本研究采用酶组合消化的方法成功实施荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养，并建立了临床乳房炎致病菌感染乳腺上皮细胞的体外模型，观察了大肠杆菌、克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌及脂多糖对乳腺上皮细胞的损伤作用，及乳腺上皮细胞的先天性免疫反应。 从泌乳中期的荷斯坦奶牛采集乳腺组织，进行乳腺上皮细胞的体外培养，成功建立了原代细胞培养方法，并建立了非转化的奶牛乳腺上皮细胞系。采用酶组合消化方法富集乳腺细胞。经原代培养，上皮细胞与非上皮细胞分区生长，分界明显。根据细胞对酶敏感性的差异，去除非上皮细胞，再用0.25％胰蛋白酶和0.4％的EDTA消化传代上皮细胞，得到纯化的乳腺上皮。细胞经角蛋白免疫组化检测，胞质阳性反应。汇合后的乳腺上皮细胞形成典型的铺路石样结构，导管样结构等。继续培养，可形成穹隆样结构。扫描电镜观察可见细胞间紧密连接并有微绒毛。透射电镜观察可见上皮细胞特有结构一桥粒。 应用RT-PCR检测到TLR4、TLR2、CD14在乳腺组织和培养的原代乳腺上皮细胞中表达，而MD-2在原代乳腺上皮细胞中表达，而乳腺组织中未检测到。 乳房炎致病性大肠杆菌能够粘附和侵入乳腺上皮细胞，并有时间和剂量依赖性。采用半定量RT-PCR检测，发现大肠杆菌促进了乳腺上皮细胞TLR4、CD14、MD-2、IL-1和TNF-α[mRNA的表达，并且IL-1和TNF-α在蛋白水平上也出现同样上升。本实验的结果将有助于我们理解临床慢性大肠杆菌乳房炎的致病机理。 临床分离的乳房炎致病性肺炎克雷伯氏菌能够粘附单层培养的原代乳腺上皮细胞，并检测到细胞内有侵入的肺炎克雷伯氏菌，说明肺炎克雷伯氏菌对乳腺上皮细胞有一定的侵袭力，粘附有一定的剂量和时间依赖性，侵袭在2h后无时间依赖性。克雷伯氏菌上调了乳腺上皮细胞表达TLR4、CD14、IL-1、IL-8及TNF-α基因水平，与蛋白分泌基本一致。 高浓度的LPS降低了原代培养的乳腺上皮细胞的增殖速度。中浓度的LPS上调了乳腺上皮细胞表达TLR4、CD14、MD-2基因水平，同时明显上调了lL-1、IL-8、TNF-α基因的表达水平，刺激前后差异显著，IL-1和TNF-α蛋白分泌差异显著。IL-6和IL-8差异不显著。 乳房炎致病性金黄色葡萄球菌粘附和侵袭原代培养的乳腺上皮细胞，能够通过TLR2介导细胞对金黄色葡萄球菌的反应，上调TLR2和CD14基因的表达，但除了TNF-α外，没有发现明显的炎症前因子的释放。 原代乳腺上皮细胞分泌炎症前因子，识别病原菌，上调了Toll样受体的表达。因此，乳腺上皮细胞能够识别病原菌及其细胞壁成分，激发先天性免疫。