微生物转化发酵法生产天然香料β-苯乙醇的研究

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本论文以酵母细胞生物转化生成的天然香料β-苯乙醇为研究对象,主要研究内容包括:转化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇酵母菌株的筛选;发酵液中底物和产物的定量检测方法;摇瓶培养条件的优化,包括培养基组成的优化及培养工艺的优化;树脂的筛选及发酵液中β-苯乙醇的分离纯化;β-苯乙醇的结构鉴定。从实验室保藏的41株酵母菌种中筛选出一株酵母:Kluyveromyces marxious AS.2.1440,能够将7.0g/L的L-苯丙氨酸转化为0.920g/L的β-苯乙醇。根据L-苯丙氨酸和β-苯乙醇的化学结构特征,建立了测定发酵液中底物和产物的方法:薄层层析法、碘蒸汽熏蒸半定量测定β-苯乙醇;水合茚三酮测定底物L-苯丙氨酸;高效液相色谱同时测定发酵液中的底物和产物,该法处理简单、快速、定量准确、回收率高、重复性好,可有效的用于β-苯乙醇产生菌的菌种选育和发酵工艺研究中。为了提高产物浓度,对培养基配方和发酵条件进行优化,确定了优化了的培养条件:蔗糖35g/L、L-苯丙氨酸6g/L,磷酸二氢钾0.4g/L,YNB1.8g/L;种子培养基培养24h,接种量6%,优化培养基初始pH=5.5,装液量50mL/250mL,温度28℃,转速220r/min。在此条件下发酵48h后发酵液中β-苯乙醇含量可以达到1.4097g/L,比优化前(0.920g/L)提高了53.23%。通过对13种大孔吸附树脂静态吸附特性的研究,确定了H103树脂是一种理想的β-苯乙醇的吸附剂,该吸附树脂对β-苯乙醇不仅吸附量大,而且解吸率高,适合发酵液这种复杂的生物转化体系中β-苯乙醇的分离富集。通过对H103树脂的动态吸附特性研究,确定了H103树脂分离富集发酵液中β-苯乙醇的工艺参数:上样浓度1.3g/L左右,上样液pH=5.48,上样速度3BV/h;用6倍树脂柱床体积的95%乙醇以2BV/h流速进行洗脱,可基本上将发酵液中β-苯乙醇完全洗脱下来,并且洗脱峰集中、基本对称,无明显拖尾现象,β-苯乙醇的回收率约为87.63%。大孔吸附树脂醇洗液经浓缩纯化后,经GC/MS分析,测定制得的β-苯乙醇纯度为93.20%;对产品峰质谱图进行Nist谱库检索,其质谱检测结果与标准β-苯乙醇的匹配度达到94%,可确定其为β-苯乙醇。
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