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水稻是重要的粮食作物和单子叶模式植物,其茎秆的机械强度是影响作物产量的重要因素之一。研究表明,茎秆次生壁的理化性质与机械强度具有高度相关性。而纤维素作为次生壁中最主要的成分,其含量与结构对茎秆机械强度的贡献极其关键。纤维素的合成与组装过程复杂,并受多种内源激素及外界环境因子等严格调控,但还没有一种激素信号能与纤维素合成调控过程相联系。赤霉素是影响植物生长发育的重要激素,关于它是否参与调控纤维素合成及相关机制如何均不清楚。本论文利用多种手段发现赤霉素及其信号通路能直接调控纤维素合成,通过揭示完整的信号通路,阐明了其中的新机制及可能的应用前景。 为了研究水稻次生壁纤维素合成的转录调控机制,我们首先对与纤维素合成关键基因纤维素合酶CESA4、7、9共表达的转录因子进行了筛选,遴选出数个NAC和MYB类转录因子。通过分析它们在不同组织中的表达情况,确定SWAF1为候选基因并开展进一步的功能研究。我们首先发现SWAF1的过表达材料表现为叶片内卷,茎秆挺直,纤维素的含量增加。而显性抑制材料SWAF1-SRDX叶片外翻,纤维素含量下降。化学诱导和凝胶阻滞实验的研究结果表明,SWAF1能够结合CESAs启动子区的GAMYB元件并直接激活CESAs的表达。为了进一步筛选调控SWAF1表达的上游基因,我们对SWAF1的启动子区进行了生物信息学分析,结果表明SWAF1的启动子区含有NAC类转录因子的结合元件SNBE。而拟南芥中的研究表明,NAC类转录因子SND1、VND6、VND7是调控次生壁形成的关键转录因子。通过同源基因筛选和表达模式分析,确定SWAF4与SWAF5为调控SWAF1表达的候选因子,并开展了遗传学和生物化学研究。过表达SWAF4和SWAF5的转基因株系纤维素含量显著增加,而且CESA4、7、9及SWAF1的表达呈上调趋势。瞬时转录激活实验和凝胶阻滞实验的研究结果表明SWAF4和SWAF5通过结合SNBE元件直接激活SWAF1的表达。这些研究结果暗示SWAF4和SWAF5位于SWAF1上游调控纤维素合成。 已有的研究表明赤霉素能够促进生物量的增加,这暗示赤霉素可能是SWAF4/SWAF5-SWAF1-CESA的调控起始信号。为此我们利用细胞学和化学测定手段对赤霉素相关突变体进行了分析,发现赤霉素合成突变体sd1的茎秆及d18-AD的叶鞘纤维素含量下降,并伴有厚壁组织细胞壁变薄的现象;而赤霉素信号传导突变体slr1的茎秆纤维素含量增加,厚壁组织的细胞壁加厚;gid1的弱等位突变体茎秆纤维素含量没有显著变化。基因表达分析表明,参与次生壁纤维素合成的关键基因CESA4、7、9在这些赤霉素突变体中的变化与纤维素含量的变化相一致。同时生理处理发现,外施赤霉素能够部分恢复cesa4/bc11纤维素缺陷的表型。为揭示SWAF4/SWAF5-SWAF1-CESA调控通路与赤霉素的关系,我们分析了SWAF1、4和5对赤霉素处理的响应情况,qRT-PCR的结果表明赤霉素能诱导这些转录因子的表达,这些结果暗示赤霉素与纤维素合成调控相关。为进一步揭示赤霉素是否直接参与纤维素合成调控,我们利用酵母双杂交和双分子荧光互补实验证实了SLR1与SWAF4和SWAF5的DNA结合结构域具有相互作用。水稻原生质体瞬时转录激活实验进一步证明SLR1能抑制SWAF4和SWAF5转录激活活性,而施加赤霉素能够消除这种抑制作用。凝胶阻滞实验的研究结果表明,SLR1可封阻SWAF4和SWAF5对SWAF1的结合。因此,赤霉素通过其关键信号转导抑制因子SLR1与SWAF4和SWAF5的互作调控它们所介导的纤维素合成过程。 上述研究揭示了赤霉素调控次生壁纤维素合成的分子机制,并证实了SWAF4/SWAF5-SWAF1-CESA是水稻中纤维素合成调控的一条重要途径。为验证该通路的生理功能,我们以发育中的水稻茎秆为材料,通过细胞学观察和化学成分分析发现,发育中的水稻茎秆次生壁纤维素含量由下至上逐渐积累,是验证该调控途径的理想材料。通过分析发育茎秆中三个CESA基因以及三个SWAF基因的表达,确认其阶层调控关系,表明了该信号途径在水稻茎秆发育过程中的重要作用。因此,该通路的解析为水稻茎秆机械强度的改良提供了重要的靶基因。