背景：毒蛇伤害是我国常见急症,严重威胁野外活动人员的身体和生命。治疗毒蛇伤害的重要有效方法是及时、足量注射对应蛇毒的抗血清。因此,快速、准确判断蛇毒的种类,是有效治疗的关键。近年研究发现,鸡卵黄抗体(IgY)和哺乳动物抗体IgG相比,具有不激活哺乳动物补体系统,不非特异性结合类风湿因子(RF),不固定葡萄球菌A蛋白,不与哺乳动物免疫球蛋白之间发生交叉血清型反应等优点。因此,将lgY运用于医学临床检测诊断中具有许多优越性。压电免疫传感器结合了石英晶体谐振器的高度质量敏感性和免疫反应的高度特异性,是当前生物传感技术研究的热点之一,和传统免疫方法相比,它具有仪器装备简单、灵敏度高、检测快速、无需标记、操作简便、成本低廉、可野外检测等特点,目前已广泛应用于临床诊断、有害物检测等诸多领域。因此,以鸡卵黄抗体作为压电免疫传感器的生物敏感材料,研制出检测蛇毒的压电免疫传感器,具有现理论与实际的意义。 目的：通过制备抗蝰蛇毒鸡卵黄抗体,并应用该抗体作为蛇毒压电免疫传感器压电免疫传感器的生物敏感材料,研制抗蝰蛇毒鸡卵黄抗体-压电免疫传感器,探索该压电免疫传感器用于蛇伤快速检测的可行性。 方法： 1.以蝰蛇毒原毒免疫莱航母鸡,以ELISA法监测特异性卵黄抗体效价的动态变化。 2.采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化鸡卵黄抗体。 3.再经SDS-PAGE电泳检测抗体纯度。 4.采用AT切割、直径5.0mm,双面镀银电极、基频为9.8MHz的压电石英晶体作为基体传感器,将鸡卵黄抗体(IgY)固定于压电石英晶体传感器银电极表面(同时以马抗蝰蛇毒IgG纯化冻干粉及精制抗蝰蛇毒血清IgG作对照),探讨最佳抗体固定方法及适宜抗体固定量。 5.比较鸡卵黄抗体与对照抗体制备的蝰蛇毒压电免疫传感器在PBS溶液环境中检测蛇毒的灵敏性、特异性。 6.比较不同封阻剂对于血清样品检测的影响,以确定最佳封阻方法。 7.将制备的蝰蛇毒压电免疫传感器用于检测蛇毒血清标准品及实际蛇伤中毒小鼠的血清,探讨该传感器用于血清环境中检测蛇毒的灵敏性及特异性。8.对所制备传感器作储存寿命测试。 结果： 1.用蝰蛇毒原毒、初次小剂量免疫后,经ELISA法卵黄中第14天可检测到特异性卵黄抗体。经间歇、逐渐加量加强免疫,抗体效价持续增高,达到较高水平(1:51200)后呈生物节律性波动并维持高效价直到第32周。 2.以水提法提取抗体,以辛酸-硫酸铵法纯化抗体,产物经SDS-PAGE(非还原状态)检测,分子量约为180KD条带即为IgY,还原状态下显示由重链(65KD)和轻链(25KD)构成。 3.将制备的卵黄抗体IgY、对照物纯化IgG冻干粉及抗蛇毒血清IgG分别固定于压电石英晶体电极上,结果表明,IgY及IgG最佳固定浓度为1.5mg/ml,抗蛇毒血清IgG最佳固定稀释度为1:10。 4.IgY与lgG用于压电免疫传感器检测PBS溶液中的蛇毒时灵敏度为0.5μg/ml;而抗蛇毒血清IgG灵敏度为10μg/ml,较前两者低。 5.通过不同封阻方法的比较,确定IgY传感器与IgG传感器均以1％BSA为封阻剂最佳。 6.以上述方法所制备的IgY蝰蛇毒压电免疫传感器在健康人血清环境中,可检测出浓度在0.5μg/ml以上的蝰蛇毒,线性范围为0.5～10μg/ml,线性方程y=8.0302x+56.2,相关系数为0.960;制备的IgG蝰蛇毒压电免疫传感器在健康人血清环境中,可检测出浓度在1μg/ml以上的蝰蛇毒,线性范围为1～12.5μg/ml,线性方程为y=6.0205x+84.869,相关系数为0.9846。 7.在健康人血清环境中检测其他蛇毒,两种压电免疫传感器均对眼镜蛇科的眼镜蛇、眼镜王蛇、银环蛇蛇毒无交叉反应,对高浓度(10μg/ml)蝮蛇科的蝮蛇、五步蛇、竹叶青、烙铁头蛇毒存在轻度交叉反应。 8.蛇伤中毒小鼠血清样品经IgY传感器检测,蝰蛇毒组打毒后45分钟血清样本检测结果为阳性,打毒2小时后结果检测为可疑,其他蛇毒组不同时间检测结果均为阴性；而经IgG传感器检测,蝰蛇毒组打毒45分钟后血清样本检测结果为阳性,打毒2小时后结果检测为阴性,其他蛇毒组不同时间检测结果均为阴性。 9.于4℃密封环境中,IgY传感器可保存4周,IgG传感器可保存3周。 结论： 1.蛇毒易于诱导母鸡产生高效及特异性IgY抗体。由于采用鸡作为免疫媒体,可从鸡蛋中连续获取大量均一的特异性免疫球蛋白IgY,因此母鸡将是制备和生产新型抗蛇毒抗体的有效生物反应器。 2.鸡卵黄抗体-压电免疫传感器具有灵敏度高、特异性好等优点,有用于蛇毒快速检测的前景。该研究为研制用于蛇伤快速检测的压电免疫传感器奠定了基础。