自百年前一场“世纪大流感”的爆发以来,人类与流感的斗争从未停止,接种疫苗是当下预防流感最为经济有效的手段。随着科技的进步,采用细胞培养技术进行的流感疫苗生产逐渐替代传统的鸡胚培养方式成为主流。由于人们对流感病毒在疫苗生产宿主细胞中的增殖机制以及宿主细胞与病毒间相互作用的认识有限,现有的工艺开发往往采用基于经验的参数筛选方式,难以准确有效地调控病毒扩增过程以实现真正科学、理性地设计、开发和优化病毒疫苗生产工艺。此外,常用于流感病毒疫苗生产的MDCK-NBL2细胞系实为混合细胞群体,其中弱产毒能力的细胞将消耗养分、破坏培养环境,从而阻碍病毒生产,且不均一的细胞系经长期传代后往往会导致病毒生产过程的不稳定。因此如何获得高产且稳定的细胞株、如何提高流感病毒生产效率仍然是当今流感疫苗生产过程研究开发需要克服的难题。鉴于此,本文以MDCK-NBL2细胞系（母本细胞P）的不均一性为切入点,考察了若干子代克隆的差异,并获得了相对高产且稳定的细胞克隆（高产细胞H1）。然后,深入研究该高产细胞本身的基本特征、病毒在高产细胞中的扩增规律以及病毒繁殖时高产细胞的细胞维持、生理代谢和基因表达特征等,以认识高效生产流感病毒的关键细胞特性。最后,以高产细胞H1的基因表达特征为依据对母本细胞P的病毒扩增过程进行实验干预,以揭示能够精准调控细胞产毒能力的潜在靶点。首先,本文详细地描述了 MDCK-NBL2细胞系在多个方面的不均一性,包括其不同子代克隆细胞的病毒生产能力分布广、细胞形态差别大、唾液酸受体含量差异明显、病毒生产的稳定性各异等。其中,一株稳定且高产的克隆细胞H1的最高单细胞病毒产量超过30×103 virions/cell,约为母本细胞P的2倍,也是目前文献报道的最高水平,且该高产细胞生产的子代病毒中感染性颗粒的比例与母本细胞相当。此外,该高产细胞H1也可连续稳定传代,其20天的平均比生长速率为0.95 d-1,属于生长速度较快的细胞系,有利于实现大规模培养。随后,对该高产细胞H1和母本细胞P的病毒扩增过程以及它们在病毒感染前后的物质能量代谢、细胞生理状态和胞内基因表达特征进行深入研究,发现（1）无论病毒感染与否,H1细胞均具有较高的核糖体和蛋白翻译功能以及线粒体和能量代谢相关功能,为高产细胞的固有特征,且H1细胞本身还有具有较高的DNA复制能力以及较低的钙信号通路和腺苷酸环化酶功能。这些特征均有利于细胞的维持和病毒基因的表达。（2）MDCK细胞在病毒感染后6 h左右开始释放子代病毒颗粒,且病毒感染能够引起细胞凋亡、胞内线粒体膜电势下降,并使细胞直径和蛋白水平产生先上升后下降的趋势。而H1细胞的高产性主要得益于产毒中后期较高的病毒释放速率和细胞维持能力,其中,细胞维持能力包括活细胞密度、细胞活性、细胞直径、胞内蛋白水平、线粒体含量和线粒体膜电势等的维持水平。（3）病毒感染能够引起细胞的代谢重编程,而H1细胞在病毒感染后具有较高的葡萄糖代谢水平,且其较强的线粒体与能量代谢功能有利于缓解由病毒感染引起的线粒体损伤,从而使消耗的葡萄糖更多地流向三羧酸循环和能量代谢通路,为胞内病毒的大量增殖提供更多的物质能量保障。（4）被病毒感染后,胞内的病毒mRNA占比可高达总mRNA水平的25%以上,其中五个病毒基因（PB2、PB1、NP、M1和M2）在H1细胞中的表达量较高,不仅利于子代流感病毒的包装,还有益于病毒对宿主细胞抗病毒效应的拮抗作用。（5）流感病毒感染引起H1细胞和P细胞产生相似的宿主细胞基因表达应激,这些应激主要与Host Shutoff和炎症反应有关,然而这些基因表达在H1细胞和P细胞中的应激程度却明显不同。病毒感染后H1细胞具有较低的抗病毒基因表达水平,有利于病毒在胞内的扩增。结合其较低的内质网压力相关基因表达、较少的氨基酸消耗和较好的胞内活性氧水平维持能力,提示H1细胞具有较小的蛋白质加工压力,能为病毒扩增减少障碍的同时也减轻细胞自身的负担,从而使得H1细胞既能高效生产流感病毒,还能够保证细胞自身的存活。最后,基于上述认识,通过在低产的母本细胞P的产毒过程中添加5 mmol/L的活性氧抑制剂,使得其在8 hpi时的胞内活性氧水平下降了 43.15%,并相应地使病毒产量提高了 46%;且添加10 μmol/L的NFκB抑制剂能够显著提高其线粒体膜电势,并使病毒产量提高了 76%,说明胞内活性氧水平和天然免疫反应能够作为调控病毒感染复制的靶点。通过本文的研究,首次深入认识了病毒在高产MDCK宿主细胞中的扩增规律及其调控机制,并挖掘出高产细胞的生理代谢和基因表达特征,一方面为理性的高产细胞株筛选和细胞株改造提供依据,另一方面为未来开发并建立基于MDCK细胞大规模高密度培养技术的流感病毒疫苗高效生产工艺提供科学指导。同时,本文的研究结果也可为其它病毒类疫苗的开发和生产提供借鉴。