第一部分脂肪干细胞移植促进预构皮瓣的血管化研究背景：烧伤及其他创伤引起的颜面部创伤畸形是整形外科临床上常见的病例,由于其缺损复杂、合适的供区少、修复要求高,是临床治疗中的一个难点。这类畸形和缺损由于对功能和外形的要求较高,单纯植皮通常不能满足修复要求,而邻近部位缺乏合适的皮瓣供区,也难以通过局部皮瓣转移来达到最终修复的目的；若使用游离皮瓣进行修复,则存在受供区血管分布类型限制、通常需要二期修薄、供区继发畸形较明显等缺点。预构皮瓣是根据受区需要,通过血管载体植入的方式,在不含轴型血管的区域构建出的可带血供转移或移植的组织瓣。从理论上来讲,它可以利用人体任何已知的轴型血管,与任何需要移植的组织进行复合,来人为制造出一块新的带轴型血供的组织瓣。这种根据受区的组织类型、形态和功能的需要“定制”的皮瓣,是治疗复杂的畸形和缺损,尤其是颜面部畸形缺损的理想的手段。但是,预构皮瓣存在血供程度和范围难以预计,继而会发生不可预料的远端坏死的缺点——因为皮瓣预构的过程,是血管载体与受区组织之间再血管化、组织再生的过程,本身存在很多不可控因素,所以如何控制这个再血管化过程,促进血管载体和供体组织之间的“联系”和再生,是防止预构皮瓣术后坏死的关键。细胞治疗是指应用自体、异体或同种异体的细胞,经体外操作后回输(或植入)人体,以达到治疗、诊断或预防作用的目的。近年来,随着人们对干细胞研究的不断深入,细胞治疗的应用领域不断拓宽,从传统的输血、造血干细胞移植延伸到了肿瘤治疗、糖尿病、冠心病、血管疾病的治疗等领域。大量的动物实验和一些临床研究已经证明,细胞治疗能有效地促进血管生成和创面愈合,保护缺血缺氧组织,促进组织再生。在细胞治疗的这个应用领域里,骨髓基质干细胞、脂肪干细胞和内皮祖细胞等都被证实有促进组织再血管化的作用。骨髓来源的间充质干细胞和内皮祖细胞由于其来源有限,且采集骨髓会对人体造成一定的创伤,因此在应用上有一定的局限性。而脂肪组织在整形外科可以很容易大量获得,特别是随着抽脂术的普及,整形外科医生可以经常在术中取得大量多余的脂肪,如果能够从这些多余的脂肪组织中提取出脂肪干细胞,来用于促进组织再生和血管化,将起到“变废为宝”的效果。因此,本课题拟采用脂肪干细胞作为种子细胞,来探讨其促进皮瓣预构进而促进预构皮瓣成活的可能性。目的：探索脂肪干细胞用于促进皮瓣预构过程中血管载体与供体组织之间的血管化和组织再生,进而促进预构皮瓣成活的可能性。方法：1、分离培养wistar大鼠脂肪干细胞。无菌条件下切取3-4周雄性wistar大鼠腹股沟脂肪垫,尽量剔除血管及筋膜组织,将脂肪剪碎后置0.1%胶原酶中,37℃振荡消化1小时,加入等体积完全培养基(低糖DMEM+10%胎牛血清+1%青／链霉素),低速离心10分钟后,吸走上层脂肪及液体,将细胞沉淀用完全培养基重悬,单细胞滤网过滤后接种于培养皿,置37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后首次换液,此后每三天换液一次,细胞融合至约80%-90%时按照1：3的比例传代。将第2代的脂肪干细胞接种于六孔板中,待细胞融合至约60%时,分别置成骨、成软骨、成脂诱导培养基中诱导培养,每3天换液一次,诱导4周后,分别行茜素红染色、Ⅱ型胶原染色及油红O染色鉴定。2、分离培养wistar大鼠软骨细胞。无菌条件下切取成年雄性wistar大鼠股骨头及膝关节软骨,剪碎后置0.25%胰蛋白酶中,37C°振荡消化半小时,磷酸盐缓冲液(PBS)洗去胰酶后置0.1%胶原酶中振荡消化过夜,然后离心、弃上清,沉淀重悬于含10%胎牛血清和1%青/链霉素的完全培养基中,单细胞滤网过滤后接种。3天后首次换液,此后隔天换液1次,细胞融合至约80%-90%时按照1：3的比例传代。3、建立大鼠预构皮瓣模型。预构皮瓣模型由两期手术组成：一期手术,取成年雄性wistar大鼠,体重280-350g,麻醉后设计大鼠腹部6-8cm×6-8cm大小矩形皮瓣,上至剑突,下至外生殖器上1cm,两侧至腋前线。沿上方和两侧切开,由头端向尾端将皮瓣掀起。结扎双侧腹壁浅动脉。解剖出右侧股血管束,结扎分支血管,保留股动静脉血管周围少量肌肉以保护血管,在踝关节水平结扎股血管束。分离右侧腹股沟水平皮瓣与肉膜间的间隙,形成约2cm宽皮下隧道。将股血管束经皮下隧道转位,以“6-0”可吸收缝线沿对角线固定于腹部随意皮瓣肉膜面。彻底止血后,氯霉素溶液冲洗创面,皮瓣原位缝合,关闭术腔。4周后行二期手术,沿原切口线切开大鼠腹部矩形皮瓣四边,掀起以植入的股血管束为蒂的岛状皮瓣,原位缝合,术后5-7天评估该预构皮瓣的成活情况。4、实验分组。按照如下的实验分组(n=12)分别在预构皮瓣一期手术时,于皮瓣的肉膜面,在股血管束末端周围均匀注射0.5ml细胞悬液或PBS：A组(实验组)：2×106脂肪干细胞混悬于0.5ml PBS中；B组(阴性对照组)：2×106软骨细胞混悬于0.5ml PBS中；C组(空白对照组)：0.5ml PBS.5、皮瓣预构效果观察。分别在一期和二期术中,在腹部矩形皮瓣掀起、血管束转位以后,用激光血流仪于皮瓣肉膜面观察皮瓣血流分布情况。6、皮瓣存活率评估。二期术后即刻以半透明纸拓下皮瓣总面积。二期手术后5-7天以半透明纸拓下皮瓣存活面积,皮瓣坏死标准为皮瓣的颜色变黑、组织回缩、质地变硬或坏死形成创面。面积用Motic images Advanced 3.2系统进行摄像分析,存活面积除以皮瓣总面积即为皮瓣存活率。各组皮瓣成活率用均数±标准差表示,数据输入SPSS16.0统计软件,行单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。7、皮瓣微血管密度评估。在评估皮瓣成活率的同时,切取植入的股血管束末端近旁成活的皮瓣组织,常规石蜡包埋后切片行Von Willebrand因子(vWF)免疫组化染色,每只实验动物随机选取3张切片,每张切片随机选取10个100倍视野,于显微镜下计数每平方毫米内染色阳性的微血管数,求其平均值。各组间比较同样采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。8、血管内皮生长因子的检测。分别于传代后第2、4、6、8、10、12天,收集培养第2代的脂肪干细胞的上清液,行血管内皮生长因子(VEGF)的ELISA检测。另取成年雄性wistar大鼠54只行一期手术,同样分为脂肪干细胞组、软骨细胞组和PBS组,每组18只,分别于一期手术后第1、4、7天,每组切取6只大鼠皮瓣,每个皮瓣切取4块组织,匀浆后提取蛋白行VEGF的ELISA检测。组间差异使用重复测量的方差分析进行比较。结果与讨论：1、原代培养的大鼠脂肪干细胞约5-7天左右可形成较大的克隆,约7-10天左右第一次传代,此后每3天按照1：3的比例传代。原代细胞体积较小,传代后细胞体积增大,呈成纤维细胞样形态。经过三向诱导的脂肪干细胞分别行油红O染色、茜素红染色及Ⅱ型胶原染色鉴定,结果均为阳性,说明它能向脂肪、骨及软骨方向分化,具有间充质干细胞的特性。2、大鼠腹部预构皮瓣一期术后,三组皮瓣均无坏死,皮瓣轻度收缩,但未发生皮瓣坏死,无创面出现。在二期术中,用激光血流仪观察皮瓣的肉膜面,可见植入的股血管束与皮瓣之间形成了良好的血液循环。二期术后三组皮瓣均有不同程度坏死,坏死以远端为主,偶有血管束根部的皮瓣发生小面积局限性坏死。用皮瓣的存活面积除以二期术后的初始面积,得到皮瓣成活率,行统计分析结果发现ASCs移植组的皮瓣存活率(30.71±6.99%)显著高于PBS对照组(19.90±4.40%)和软骨细胞对照组(17.53±4.38%),p<0.001。而软骨细胞对照组和PBS对照组之间没有统计学差异(p>0.05)。3、三组皮瓣的组织切片行vWF因子免疫组化染色,计数染色阳性的血管内皮细胞数目,结果发现脂肪干细胞组的血管密度(27.85±13.64/mm2)显著高于PBS对照组(10.18±5.74/mm2)和软骨细胞对照组(7.63±4.24/mm2),p<0.001。软骨细胞对照组和PBS对照组之间没有统计学差异(p>0.05)。4、取培养的脂肪干细胞的上清液行VEGF检测,可见脂肪干细胞能分泌VEGF,且在传代后7天内分泌水平逐渐升高,此后略下降维持在一定水平。在预构皮瓣一期术后第1、4、7天,分别切取各组皮瓣组织行局部VEGF浓度检测,发现术后脂肪干细胞组的VEGF浓度呈上升趋势,而PBS组和软骨细胞对照组则没有。在第4天和第7天,脂肪干细胞组的VEGF浓度(1665.77±323.49pg/ml和2821.82±654.88pg/ml)显著高于PBS对照组(923.20±115.54pg/ml和1190.00±400.33pg/ml)和软骨细胞对照组(193.40±32.57pg/ml和266.45±103.50pg/ml), p<0.001。并且软骨细胞对照组的VEGF浓度在第4天(p<0.001)和第7天(p<0.05)分别低于PBS对照组。第二部分血管内皮生长因子转染脂肪干细胞提高其促进皮瓣预构的能力研究背景：对于细胞因子促进缺血缺氧组织血管化,保护组织成活,已经有很长时间的报道,但是细胞因子的应用存在作用时间短,局部易流失的问题。基因治疗也有报道能促进皮瓣成活和再血管化,但是基因治疗所使用的病毒载体本身对宿主有很大的副损伤。因此,在第一部分观察到皮瓣局部的VEGF细胞因子浓度与皮瓣的成活有相关性的基础上,我们拟采用将VEGF的基因转导入种子细胞内的方法,来放大种子细胞促进皮瓣预构的能力,同时又避免基因治疗的病毒载体对宿主的副作用。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,在体内和体外均可特异性地促进血管内皮细胞生长并诱导血管形成,是刺激血管内皮细胞增殖和移行的重要因子,并可影响血管的通透性,是目前已知最强的炎症介质。它共有5个亚型,其中VEGF-A是最早发现也是作用最强最广的一种亚型,由于其mRNA的剪接方式不同,VEGF-A又有7种存在形式,其中VEGF121、VEGF145、VEGF165(人类,啮齿类的氨基酸数目要偏少)均能诱导内皮细胞增殖和体内新生血管形成。由于cDNA扩增丰度中VEGF165最高,所以在临床和动物实验中,VEGF165是应用最多的一种单体。本实验中我们也选择VEGF165作为目标基因,用腺病毒载体将目的基因转导入脂肪干细胞内,再将脂肪干细胞植入预构皮瓣模型,观察细胞与基因治疗相结合,是否能起到更好的促进血管化效果。目的：探讨脂肪干细胞经过VEGF基因修饰后,其促进预构皮瓣再血管化的能力是否能得到提升。方法：1、Ad.VEGF165及Ad.EGFP的构建和鉴定。使用AdEasy载体系统,体外构建含目的基因VEGF165的重组腺病毒Ad.VEGF165和含有报告基因EGFP的空载病毒Ad.EGFP,该部分工作主要由上海第二军医大学长海医院心胸外科研究所完成。2、Ad.VEGF165体外转染脂肪干细胞。先用Ad.EGFP按照不同的感染复数(MOI)值转染脂肪干细胞,转染后3-5天,用流式细胞仪检测不同MOI值下的转染效率后,选择合适的MOI值用Ad.VEGF165进行转染。3、转染后脂肪干细胞的细胞生物学观察及目的蛋白的表达。脂肪干细胞按照选定的MOI值转染Ad.EGFP后,与未转染的同代次细胞一起行MTT检测,比较其增殖活性的差异。脂肪干细胞转染AdVEGF.165以后,提取细胞上清液行VEGF 165的ELISA检测,连续检测10天以上,观察其目的蛋白分泌的情况。4、大鼠预构皮瓣动物模型。同第一部分。此组每只大鼠注射经Ad.VEGF165转染的脂肪干细胞2×106,二期手术后行皮瓣存活率与微血管密度检测,与第一部分的数据进行对比。结果与讨论：1、脂肪干细胞传代后第2天,处于S期的细胞所占比例最高,故选择在传代后第2天对脂肪干细胞进行Ad.EGPF转染。当MOI值<100时,转染后细胞无明显凋亡坏死；而当MOI>100后,细胞损伤较明显,一般转染后3-5天即开始变圆、脱壁。流式细胞仪检测转染效率的结果提示,当MOI>50后,阳性率增加不明显,主要是阳性表达增强,遂选择MOI=50进行转染。2、脂肪干细胞转染Ad.EGFP后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,与未转染的细胞相比,传代后第2-8天的MTT生长曲线结果基本一致,说明该腺病毒载体按照最适MOI值转染脂肪干细胞,对细胞活力无明显影响。脂肪干细胞转染Ad.VEGF165后,连续收集14天的细胞上清液,行VEGF165的ELISA检测,结果证实转染后的大鼠脂肪干细胞能分泌人VEGF165蛋白,第6天时达高峰,此后逐渐下降。3、将转染了VEGF165的脂肪干细胞植入大鼠预构皮瓣动物模型,结果发现该组皮瓣存活率及微血管密度与单纯脂肪干细胞移植组相比,均有显著提高,说明VEGF的基因修饰确实能提高脂肪干细胞促进预构皮瓣再血管化的能力。全文小结：1、本实验建立大鼠腹部预构皮瓣模型,使用脂肪干细胞作为种子细胞,局部注射移植后,达到了促进皮瓣预构的目的,具体表现为预构皮瓣成活率上升,皮瓣局部微血管密度增高,而软骨细胞阴性对照组未能观察到同样的现象,说明脂肪干细胞能够促进预构皮瓣的血管化和组织再生。2、本实验对最有代表性的促血管化细胞因子VEGF进行了体内外检测,发现体外培养的脂肪干细胞能够分泌VEGF。对各实验组皮瓣中的局部VEGF浓度进行检测后也发现,脂肪干细胞组的VEGF浓度显著高于PBS对照组和软骨细胞对照组,而软骨细胞阴性对照组的VEGF浓度甚至低于PBS空白对照组,说明细胞移植促进预构皮瓣的血管化,可能与促血管化细胞因子(如VEGF)的分泌有关。3、在上述结论的基础上,本实验对脂肪干细胞进行了VEGF基因修饰,使用腺病毒载体,对其转染了人VEGF165目的基因,转染后可见目的蛋白的表达,将转染后的脂肪干细胞植入预构皮瓣动物模型,与单纯植入脂肪干细胞的预构皮瓣进行对比,发现其皮瓣成活率及微血管密度都得到了显著提高,说明基因转染与细胞治疗相结合,能够提高细胞治疗的效果,同时又避免了基因治疗的副作用。