颈椎病是困扰口腔医生的一种常见慢性疾病。研究表明,颈椎病发生的主要原因是以椎间盘退变为基础的颈椎退行性变。椎间盘退变构成大多数脊椎肌肉骨骼疾病的病理基础,包括退行性椎管狭窄,椎间不稳,颈椎综合征等。骨质疏松与椎间盘退变存在一定的相关性,骨质疏松会引发甚至加重椎间盘退变。但是椎间盘与椎骨的发生发育、退变和再生修复是一个复杂过程,确切分子生物学机制尚不明确。因此,对于椎间盘与椎骨的退变机制与自我修复机理的深入研究可为椎间盘退行性疾病与椎骨退变的预防和治疗提供理论指导。目的:利用斑马鱼这类新型模式动物来构建椎间盘损伤模型,探讨椎间盘重度损伤模型应用于椎间盘退行性疾病的研究,为深入探究椎间盘退变与椎骨退变的分子调控机制奠定基础。方法:本研究通过分子克隆的生物学技术手段构建重组质粒p Bluescript II-KS-twhh-Dendra2-NTR,借助显微注射的方式将0.15ng经纯化过的重组质粒注射到单细胞期的胚胎的动物极,经过三代连续传代,我们培养出稳定的斑马鱼Tg(twhh:Dendra2-NTR)转基因鱼系。利用Mtz/NTR系统对斑马鱼椎间盘的重度损伤来模拟椎间盘退变,组织切片HE染色观察椎间盘与椎骨组织形态学的改变、TUNEL实验揭示椎间盘细胞凋亡的特点,Micro CT扫描来评估椎体骨组织的微观结构差异、原位杂交检测椎体中成骨细胞与破骨细胞相关基因的表达变化。结果:通过分子克隆的生物学技术手段成功构建重组质粒p Bluescript II-KS-twhh-Dendra2-NTR。利用显微注射的方式培育出稳定的斑马鱼Tg(twhh:Dendra2-NTR)转基因鱼系。借助激光共聚焦显微镜扫描Tg(twhh:Dendra2-NTR)转基因鱼揭示斑马鱼椎间盘发育过程:在幼鱼早期绿色荧光细胞标记脊索细胞和底板细胞,茜素红染色的红色椎骨矿化是呈环形椎体的形式,从脊索的头部向尾部逐渐发育的;在斑马鱼青年期绿色荧光细胞标记椎间盘内的纤维环和髓核细胞,茜素红染色的红色椎骨矿化开始向前后端和背腹侧扩展,每个矿化的脊椎由椎体,神经弓,血管弓三个部分组成,神经弓和血管弓都处于椎骨体的前侧边缘;在斑马鱼成年期绿色荧光细胞特异性的标记椎间盘纤维环细胞,茜素红染色的红色椎骨发育完全成熟,将绿色标记的椎间盘镶嵌在其内部,脊柱呈现明显分段模式。利用激光共聚焦显微镜扫描显示重度损伤的椎间盘绿色荧光细胞无法自我修复,茜素红染色的红色椎骨紧密相连、矿化障碍等椎骨退变的病理表型。脊柱组织切片的HE染色揭示椎间盘与椎骨组织的细胞形态方面的退变;椎间盘的细胞结构发生明显退变,椎骨的矿化受阻。TUNEL实验证实处理组中只有椎间盘纤维环细胞发生大量细胞凋亡,这与椎间盘退行性疾病中凋亡细胞数量明显增多的主要特点是一致的。Micro CT扫描揭示椎骨融合,体积变小,矿化异常等椎骨退变表型。脊柱的原位杂交技术检测证实成骨细胞与破骨细胞的相关基因表达均出现一定程度的下调。·结论:斑马鱼椎间盘重度损伤模型可用于椎间盘退变的研究。重度损伤的椎间盘发生退变进而引起椎骨退行性病变。