紫花苜蓿被誉为“牧草之王”，其营养价值位列各种牧草之首。然而，青饲时易造成家畜臌胀病成为限制其营养价值发挥与利用的重要原因。百脉根又称“瘠地苜蓿”，由于富含缩合单宁，单独饲喂其鲜草或直接放牧不会引起臌胀病发生。目前，利用体细胞杂交技术将百脉根细胞中控制单宁合成的基因转入紫花苜蓿成为改良苜蓿品质、创造新品种的重要方法和途径。但以适宜西北内陆地区栽种和利用的苜蓿品种作为原生质体分离材料并开展体细胞杂交的研究较少。因此，本论文拟通过对杂花苜蓿、紫花苜蓿和百脉根等3种豆科牧草不同品种进行体细胞培养、原生质体培养及清水紫花苜蓿和里奥百脉根体细胞杂交的研究，建立和优化3种豆科牧草原生质体分离和培养体系及紫花苜蓿和百脉根体细胞杂交技术体系。取得的主要结果如下：1、苜蓿原生质体分离和培养1)以MS固体培养基为基本培养基，适于甘农1号杂花苜蓿和甘农4号紫花苜蓿愈伤组织诱导的最佳外植体均为下胚轴，最佳激素浓度与配比及诱导率分别为3.0mg·L^-12,4-D+1.0mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-16-BA，96.7%；2.0mg·L^-12,4-D+1.0mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-16-BA，100%；适于阿尔刚金紫花苜蓿愈伤组织诱导的最适激素浓度和配比为2.0mg·L^-12,4-D+0.5mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-16-BA，下胚轴和子叶对出愈率的影响不显著（p＞0.05），诱导率分别为100%，90%。试验证明，诱导出的苜蓿愈伤组织经过一段时间的继代调整，均可酶解分离出大量活力较高的原生质体。2)以4个苜蓿品种的胚性愈伤组织为酶解材料，甘农1号、甘农4号和清水紫花苜蓿的最佳酶液组合均为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶，最适酶解时间分别为12h、14h和10h。阿尔冈金的最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶+0.3%离析酶+0.3%崩溃酶，最适酶解时间为12h。适宜4个苜蓿品种原生质体酶解的最佳甘露醇浓度分别为：甘农1号0.75mol·L^-1，甘农4号0.65mol·L^-1，阿尔冈金0.6mol·L^-1，清水紫花苜蓿0.55⁰.6mol·L^-1。最佳愈伤组织继代培养时间均为第12d。适宜4个苜蓿品种愈伤组织酶解的最佳预处理措施分别为，甘农1号0.55mol·L^-1蔗糖或CPW溶液中处理1h，甘农4号预低温处理1h或0.55mol·L^-1蔗糖溶液中处理1h，阿尔冈金和清水紫花苜蓿均为0.55mol·L^-1CPW溶液中处理1h。4个苜蓿品种原生质体最高产量可达2.48×10⁶个·g^-1（甘农4号），最大活力值为93.1%（清水紫花苜蓿）。3)采用液体浅层培养法和固液双层培养法，4个苜蓿品种在含KM8P培养液的培养基上培养第2³d，均可观察到原生质体再生细胞的第1次及多次分裂，第7¹4d形成肉眼可见的微愈伤组织，转入含0.5³mg·L^-12,4-D，0.5¹mg·L^-1NAA、0⁰.5mg·L^-16-BA和0⁰.5mg·L^-1KT的固体培养基增殖与继代，最终均获得了原生质体再生的愈伤组织。固液双层培养法较液体浅层培养法形成再生细胞团的时间较早，操作简便且不易污染，更有利于苜蓿原生质体早期的分裂和再生。2、百脉根原生质体分离和培养1)以MS固体培养基为基本培养基，适于里奥愈伤组织诱导的最佳外植体为下胚轴，最佳激素浓度和组合为：1.0mg·L^-12,4-D+2.0mg·L^-1KT，诱导率为92.2%；在仅含0.5³.0mg·L^-1KT的MS基本培养基上下胚轴和子叶诱导1个月左右均可直接生成胚状体和小苗，经2³次继代发育成完整植株。2)适于里奥无菌苗子叶和胚性愈伤组织原生质体分离的最适酶液组合均为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶，最佳酶解时间分别为6h及12h，最适甘露醇浓度均为0.55mol·L^-1。里奥愈伤组织分离原生质的最佳继代培养时间为第8d；0.55mol·L^-1CPW溶液中预质壁分离1h或预暗培养1d均可显著（p＜0.05）增加其原生质体的产量和活力。子叶和愈伤组织原生质体最高产量和活力分别可达4.13×106个·g^-1，65%和3.8×106个·g^-1，67.4%。3)采用液体浅层培养法，由子叶和胚性愈伤组织分离的原生质体在KM8P+1.0mg·L^-12,4-D+2.0mg·L^-1KT+13.0%(0.7mol·L^-1)甘露醇的培养基上可持续分裂并形成肉眼可见的微愈伤组织，当愈伤组织长到直径0.5mm左右时，转入含相同激素浓度的MS固体培养基上增殖和继代。大量的体细胞胚胎和再生小植株在含MS+2.0mg·L^-1KT+0.7%琼脂+12.0%蔗糖的培养基中发生。从原生质体第一次分裂至再生植株仅需3⁴个月。再生植株移栽成活率达95%。3、苜蓿和百脉根的体细胞杂交1)3¹0mmol·L^-1的IOA和40⁷0μg·m L^-1的R-6G分别处理10min，可使清水紫花苜蓿和里奥百脉根原生质体的活力及植板率明显下降，各处理浓度与原生质体活力和植板率之间均存在极显著的负相关（p＜0.01）。培养第7d，所有处理均可见再生的小细胞团，培养30⁴0d，2种抑制剂临界浓度下原生质体均丧失形成愈伤组织的能力。适宜2种豆科牧草的抑制剂及临界浓度分别是：清水紫花苜蓿3mmol·L^-1IOA或40μg·m L^-1R-6G；百脉根5mmol·L^-1IOA或50μg·m L^-1R-6G。2)FDA、罗丹明B、罗丹明6G和吖啶橙均可使苜蓿原生质体清晰染色，可用于细胞融合时亲本原生质体的标识。其中，FDA染色最为清晰，是检测原生质体活力的理想染料。吖啶橙和DAPI可对细胞核进行特异性染色，可用于融合时细胞核的观察和计数，前者还可用于检测融合细胞的活力，为进一步研究摸索融合条件和融合细胞的培养提供理论依据。3)在已摸索出的最佳酶解和培养条件下，用3mmol·L^-1IOA和50μg·mL^-1R-6G分别处理清水紫花苜蓿和里奥百脉根愈伤组织来源的原生质体，利用PEG高Ca高pH值法诱导二者融合，最佳PEG浓度为35%，异源融合率为3.1%。利用固液培养法，杂种融合细胞在培养第4d出现第一次细胞分裂，2周后形成肉眼可见的微愈伤组织。待愈伤组织直径达0.5cm左右，转入MS固体培养基。经3⁴次继代，最终获得杂种愈伤组织。