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背景和目的脓毒症是由于宿主对细菌等感染的反应失调所导致的危及生命的严重器官功能障碍,病情进展迅速,严重情况下可出现脓毒症休克和多器官功能障碍,致死和致残率高,是临床中危重症病人死亡的主要原因之一。目前临床上对脓毒症多以对症及支持治疗为主,尚无特效疗法。脓毒症发病的病理生理机制复杂,是多系统、多环节共同作用的结果。在细菌和内毒素等始动因素的作用下,机体大量释放细胞因子和趋化因子等炎性介质。各内源性因子相互作用形成网络效应,引起炎症反应的级联放大,造成凝血、免疫、内分泌等多系统及器官的损伤及功能失调。既往一些针对脓毒症病理过程中单一因素或单一环节进行调控的努力均宣告失败,提示脓毒症的治疗应从控制感染、减少毒素、平衡炎症、修复组织等方面综合考量。多项动物实验显示,间充质干细胞可以通过平衡炎症反应、调节免疫状态、改善器官功能、降低细菌负荷等途径而提高脓毒症模型动物的生存率,显示了干细胞在脓毒症治疗方面的巨大潜力。杀菌/通透性增加蛋白(BPI)是一类带有正电荷的抗菌肽,可以竞争性拮抗LBP,与革兰阴性菌外膜上的LPS结合,增加细菌外膜通透性,造成菌体裂解死亡,也可以与游离的LPS结合而消除LPS的活性。LL-37具有广谱的抗菌作用,对革兰阴性菌和革兰阳性菌均具有较强杀菌能力。它既能够与LPS结合,也可以与CD14分子结合,从而阻止LPS-CD14复合物的形成,阻断LPS诱导的炎症反应的发生。我们实验室在前期研究中构建了融合蛋白BPI-LL37/LL37-BPI,然后以慢病毒为基因递送载体,制备可以分泌该两种融合蛋白的功能增强型人脐带间充质干细胞(BPI-LL37-hUC-MSCs、LL37-BPI-hUC-MSCs,以下简写为BL-h UC-MSCs、LB-hUC-MSCs)。本篇研究将从体外功能鉴定和在体动物实验两方面证实该功能增强型人脐带间充质干细胞的功能。方法采用流式细胞仪术检测两种干细胞BL-hUC-MSCs、LB-h UC-MSCs的表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表达情况,并将两种干细胞向成骨、成软骨、脂肪方向诱导分化,以鉴定其三系分化能力。收集两种抗菌型干细胞的条件培养基,与LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞共培养,ELISA法检测上清中的炎症因子水平,然后通过抑菌实验鉴定这两种条件培养对多种细菌生长的抑制作用,并采用鲎试验法检测这两种条件培养基对内毒素的中和效果。盲肠结扎穿孔法建立小鼠脓毒症模型,根据术后联用抗生素时间的不同,将该模型分为A、B两个子模型,A模型于术后6 h联用抗生素,B模型于术后24 h联用抗生素。两个子模型均分为sham组、PBS治疗组(PBS组)、h UC-MSCs治疗组(WT组),BLhUC–MSCs治疗组(BL组),术后3 h,PBS组经尾静脉注射0.2 mlPBS,WT组注射等体积的h UC-MSCs悬液(7.5×105 mL-1),BL组注射等体积的BL-h UC-MSCs悬液(7.5×105 mL-1)。术后观察各组小鼠一般状况,绘制术后120 h生存率曲线。术后48 h收集B模型各组小鼠的血清,生化检验评价肝、肾及胰腺功能,ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平,HE染色评估小鼠肝、肾、肺组织病理变化,免疫组化染色检查小鼠肝、肾、脾及肺组织cleaved-caspase-3蛋白的表达情况。结果第一部分:1.BL-h UC-MSCs与LB-hUC-MSCs表面标记物中CD29、CD44、CD90的阳性率和CD34、CD45的阴性率均大于95%,CD105阳性率降低,在部分细胞表达量减少;2.BL-hUC-MSCs与LB-hUC-MSCs均可以向成骨、成软骨和脂肪细胞方向诱导分化;3.BL-h UC-MSCs和LB-h UC-MSCs的条件培养基可以降低巨噬细胞炎症因子的表达;4.BL-h UC-MSCs和LB-h UC-MSCs的条件培养基对多种细菌的生长产生抑制作用;5.BL-h UC-MSCs和LB-h UC-MSCs的条件培养基对内毒素可以起到中和作用。第二部分:1.A模型中,h UC-MSCs对生存率的改善要优于BL-h UC-MSCs;B模型中BL-hUC-MSCs对生存率的改善要优于h UC-MSCs;2.BL-h UC-MSCs移植可以降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平;3.BL-h UC-MSCs移植可以降低血清中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、淀粉酶、肌酐和尿素等指标的水平;4.BL-h UC-MSCs移植可以改善肝脏、肾脏和肺受损的组织结构;5.BL-hUC-MSCs移植可以减少肝脏、肾脏、脾脏及肺cleaved-caspase-3蛋白的表达。结论1.构建的抗菌型干细胞BL-h UC-MSCs和LB-hUC-MSCs在体外均具有抗菌、抗炎及中和内毒素功能,相对而言,BL-hUC-MSCs的作用更强。2.移植BL-hUC-MSCs可以降低脓毒症小鼠炎症水平、保护器官功能、修复受损组织器官,最终提高了生存率。降低组织器官中cleaved-caspase-3的表达,减少细胞凋亡,是BL-h UC-MSCs发挥保护功能的一个可能机制。