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口蹄疫（Food-and-mouth disease,FMD）是一种由口蹄疫病毒（Food-and-mouth disease virus,FMDV）引起的偶蹄动物烈性传染病,严重威胁全球畜牧业的发展。目前,接种FMDV灭活疫苗是有效预防和净化FMD的重要措施,但灭活疫苗存在热稳定性差、免疫持续期短等问题。因此,研制安全有效的FMDV新型疫苗是当前的趋势。基因工程技术及合成肽免疫原性的研究为FMDV新型疫苗的研发提供了新的方向。本研究拟应用昆虫细胞/杆状病毒真核表达系统研究针对我国目前流行的猪O型FMDV的多抗原表位疫苗。FMDV VP1蛋白具有良好的免疫原性,含有多个优势抗原表位。本研究将当前国内流行的猪O型FMDV中VP1优势T、B细胞表位序列进行重复串联获得重组基因RBT,将重组基因RBT与猪免疫球蛋白Ig G Fc进行串联获得重组基因RBTFc。本研究将目的基因RBT和RBTFc分别克隆至转移载体p Fast Bac Dual中,经PCR鉴定、双酶切鉴定及基因测序验证后,获得重组转移质粒p Fast Bac Dual-2RBT和p Fast Bac Dual-2RBTFc。将重组转移质粒p Fast Bac Dual-2RBT和p Fast Bac Dual-2RBTFc分别转化至携带杆状病毒质粒Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经蓝白斑筛选后,运用PCR技术检测目的基因与Bacmid的重组情况。结果表明,目的基因RBT、RBTFc分别与Bacmid发生特异性重组,获得重组杆状病毒质粒r Bac-RBT和r Bac-RBTFc。本研究将重组杆状病毒质粒r Bac-RBT、r Bac-RBTFc分别转染至Sf9细胞中,获得重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc。将重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc分别感染Sf9细胞,通过Western blot和间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IFA）检测细胞中重组蛋白RBT和RBTFc的表达情况。Western blot结果显示,在45 k Da和65 k Da左右存在特异性条带,与重组蛋白RBT和RBTFc大小相符;IFA结果显示,感染重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc的Sf9细胞在荧光显微镜下可观察到绿色荧光。结果表明,重组蛋白RBT和RBTFc在Sf9细胞中成功表达,且具有良好的反应原性。本研究采用绝对荧光定量法测定第3代重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc的病毒滴度。结果显示,第3代重组杆状病毒Ac-RBT和Ac-RBTFc的病毒滴度分别为4.9×109 pfu/m L和3.07×109 pfu/m L。本研究分别对重组蛋白RBT和RBTFc的表达条件进行优化,采取最优表达条件对RBT和RBTFc重组蛋白进行大量表达,超声破碎裂解细胞后,通过Western blot检测RBT和RBTFc蛋白的可溶性。结果显示,超声上清样品RBT和RBTFc分别在45 k Da和65 k Da左右存在特异性条带,与RBT和RBTFc蛋白大小相符,表明RBT和RBTFc蛋白具有可溶性。我们分别将RBT和RBTFc蛋白配合ISA 201VG佐剂制备疫苗。将疫苗免疫SPF级BALB/c小鼠以初步评估疫苗的免疫原性。实验分组分别为RBT组、RBT+核酸佐剂（Nucleic acid adjuvant,NAA）组、RBTFc组、RBTFc+NAA组、FMDV灭活疫苗组和PBS对照组。首次免疫后14 d以相同剂量进行二免,于首免后7 d、14 d、21 d、28 d对各组动物进行采血,检测BALB/c小鼠血清中特异性抗体水平。结果显示,除PBS对照组外,各实验组均产生FMDV特异性抗体,且各组间抗体水平无显著性差异。结果表明,本研究制备的多抗原表位疫苗均能有效诱导BALB/c小鼠产生FMDV特异性抗体。为了进一步评估疫苗对猪的免疫原性,将疫苗免疫2月龄的猪,实验分组分别为RBT组、RBT+NAA组、RBTFc+NAA组、FMDV灭活疫苗组和PBS对照组。首次免疫后28 d以相同剂量进行二免。于首免后14 d、21 d、28 d、35 d、42 d进行采血,检测猪血清中特异性抗体水平。结果显示,除PBS对照组外,各实验组均产生较高水平的FMDV特异性抗体;首免后,RBT+NAA组特异性抗体水平显著高于RBT组（p<0.05）;二免后,RBTFc+NAA组的猪血清特异性抗体水平显著高于RBT+NAA组（p<0.05）。结果表明,本研究制备的多抗原表位疫苗均能有效诱导猪产生FMDV特异性抗体,且NAA和Ig G Fc结构域对多抗原表位疫苗有明显的免疫增强作用。综上,本研究表达的猪O型口蹄疫病毒多抗原表位重组蛋白具有良好的免疫原性,为FMDV多表位疫苗的研发提供了理论基础和技术支撑。