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背景和目的:胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤,死亡率居恶性肿瘤前列。而腹膜转移是胃癌术后最常见的转移形式,是导致胃癌患者死亡的最重要原因。胃癌腹腔转移是胃癌细胞与腹腔内环境多种细胞相互作用的结果,如胃癌细胞-腹腔免疫细胞、胃癌细胞-腹膜间皮细胞、游离胃癌细胞-细胞间相互作用等,细胞间的相互作用过程中通常伴有细胞-细胞间信息传递,细胞间信息传递在肿瘤细胞表型重塑、恶性演进过程中发挥重要作用。细胞间直接信息传递是通过细胞间连接实现的,细胞间连接包括缝隙连接(gap junctional, GJ)、桥粒连接和紧密连接。紧密连接没有通讯功能,对桥粒连接的通讯功能研究较少,而近年GJ的生物学功能备受关注。GJ是相邻质膜间形成的一种能开放和关闭的特殊通道,由彼此相对的细胞膜各提供一个连接小体(connexon)组成,每个连接小体由6个连接子(connexin,Cx)组成,这些Cx同属于一个膜蛋白家族,他们在不同的组织及器官中具有不同类型,上皮和间叶组织以Cx43表达为主。Cx43基因作为缝隙连接蛋白家族的重要成员,其介导的缝隙连接胞间通讯对细胞的增殖和分化调控及维持组织器官内细胞间的协调稳定等方面起重要作用。既往研究证实,在上皮细胞癌变过程中,Cx43基因表达下调,是细胞恶性转化的重要事件。但新近研究发现,Cx43基因与肿瘤转移关系密切,可能在肿瘤转移过程中发挥重要作用。Cx43基因在胃癌原发组织和转移组织表达情况如何,其介导的缝隙连接胞间通讯对胃癌细胞生物学行为有无影响,及在胃癌细胞突破腹膜间皮细胞屏障中是否发挥重要作用,目前仍不清楚。揭示Cx43介导的缝隙连接胞间通讯在胃癌细胞腹腔转移中的作用及机制,对胃癌腹腔转移的防治具有重要意义。为此,本课题首先检测Cx43在胃癌原发组织、腹腔脱落癌细胞、胃周转移淋巴结和腹膜转移组织中的表达及其与胃癌临床病理参数的关系;然后利用分子生物学技术,构建Cx43慢病毒表达载体和Cx43T154A慢病毒定点突变载体,感染胃癌细胞BGC-823,体外观察缝隙连接及缝隙连接胞间通讯对胃癌细胞生物学行为的影响;最后构建胃癌细胞与腹膜间皮细胞体外相互作用模型,观察Cx43介导的缝隙连接胞间通讯对胃癌细胞突破腹膜间皮屏障的影响及胃癌细胞突破腹膜间皮屏障的路径。期望通过以上研究,初步探讨Cx43介导的缝隙连接胞间通讯在胃癌细胞腹膜转移中的作用及机制,为临床防治提供新的理论和实验依据。方法:1.选择75例外科手术切除的胃癌标本、距病灶3～5cm的癌旁组织及胃周转移淋巴结,应用免疫组化技术检测Cx43和E-cadherin的表达,分析两种蛋白协同表达情况及其与胃癌临床病理参数的关系。2.应用免疫组化和免疫荧光法检测26例Ⅳ期胃癌患者配对原发灶、腹腔脱落胃癌细胞和腹膜转移组织Cx43基因表达情况。3.应用分子生物学技术,分别构建Cx43慢病毒表达载体和Cx43T154A慢病毒突变载体(其表达的Cx43蛋白仅具有GJ而无胞间通讯功能),分别命名为:pLenti-GFP-Cx43和pLenti-GFP-Cx43T154A。将上述慢病毒表达载体和空载体pLenti-GFP分别感染胃癌细胞BGC-823,然后应用MTT法、细胞体外基质粘附实验、流式细胞仪细胞周期测定、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验等体外实验,对比观察各组感染胃癌细胞增殖、粘附、细胞周期、侵袭、迁移能力的变化,分析Cx43介导的缝隙连接胞间通讯对胃癌细胞生物学行为的影响。4.构建各组慢病毒感染胃癌细胞BGC-823和间皮细胞MeT-5A体外相互作用模型,应用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)结合荧光漂白恢复技术(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP)检测各组胃癌细胞与腹膜间皮细胞间GJIC情况;LSCM观察各组胃癌细胞突破腹膜间皮屏障情况。结果:1. Cx43在癌旁组织中呈阳性表达,在胃癌组织中表达则明显下调(p<0.01);E-cadherin在胃癌组织中的表达亦显著低于癌旁组织(p<0.01)。Cx43与E-cadherin在胃癌组织中的表达呈显著正相关(r=0.567,p<0.01),两者的表达水平均随胃癌组织分化程度降低、TNM分期升高而逐渐升高(p<0.05或p<0.01)。Cx43与E-cadherin在配对转移淋巴结的表达水平显著高于原发灶(p<0.01)。2.Ⅳ期胃癌患者腹腔脱落癌细胞和腹膜转移灶Cx43表达明显上调,与配对原发灶比较,差异有统计学意义(p<0.01)。3. MTT检测结果表明,与未转染组胃癌细胞比较,pLenti-GFP-Cx43T154A组和pLenti-GFP组细胞生长和增殖能力无显著性差异(p>0.05),而pLenti-GFP-Cx43组细胞增殖能力明显降低(p<0.05),说明胃癌细胞间GJIC功能建立在调节细胞生长和增殖中发挥重要作用。细胞体外基质粘附实验结果表明,pLenti-GFP-Cx43组和pLenti-GFP-Cx43T154A组细胞体外基质粘附能力明显强于pLenti-GFP组和未转染组(p<0.05),但pLenti-GFP-Cx43组和Cx43T154A组间比较无显著性差异(p>0.05)。流式细胞仪检测证实,pLenti-GFP-Cx43组G0/G1期细胞增多,而S期和G2/M期的细胞较未转染组明显减少,差异有统计学意义(p<0.05),而pLenti-GFP-Cx43T154A组及pLenti-GFP组与未转染组之间无显著性差异(p>0.05)。Transwell侵袭实验和划痕实验结果表明,pLenti-GFP组和pLenti-GFP-Cx43T154A组细胞侵袭、迁移能力数明显强于未转染组(p<0.05) ,而pLenti-GFP-Cx43组和pLenti-GFP-Cx43T154A组间差异无显著性(p>0.05)。4.激光扫描共聚焦显微镜结合荧光漂白恢复技术检测各组胃癌细胞与腹膜间皮细胞间GJIC情况,检测结果发现,未转染组、pLenti-GFP组和pLenti-GFP-Cx43T154A组胃癌细胞不能与毗邻的腹膜间皮细胞建立GJIC,而pLenti-GFP-Cx43组胃癌细胞与腹膜间皮细胞建立GJIC,间皮细胞经激光漂白后,荧光光密度值降低,毗邻胃癌细胞内Calcein-AM通过缝隙连接通道进入间皮细胞内,使其光密度值逐渐升高。激光共聚焦显微镜观察显示,pLenti-GFP-Cx43组胃癌细胞与腹膜间皮细胞黏附后,间皮细胞收缩,细胞间连接间隙增大,胃癌细胞通过“旁迁移”(paracellular migration)方式突破腹膜间皮屏障,而未转染组、pLenti-GFP组和pLenti-GFP-Cx43T154A组胃癌细胞与腹膜间皮细胞黏附,但不能通过腹膜间皮屏障,表明Cx43介导的GJIC对于胃癌细胞突破腹膜间皮屏障是必需的。结论:1. Cx43和E-cadherin在胃癌和癌旁组织中的表达具有明显的正相关性和一致性,即在癌旁组织均阳性表达,而胃癌组织中表达均明显降低,提示Cx43和E-cadherin的异常改变在胃癌的发生发展过程中协同发挥作用。Cx43、E-cadherin与胃癌临床病理特征关系密切,其表达水平可作为判断胃癌分化程度、临床分期的参考指标之一。与原发灶比较,Cx43和E-cadherin在胃周转移淋巴结表达明显上调,提示Cx43和E-cadherin在胃癌淋巴转移中发挥重要作用。2. Cx43在胃癌腹腔转移的不同阶段蛋白表达丰度不同,其在腹腔脱落癌细胞和腹膜转移组织中的表达水平明显高于原发灶,表明Cx43参与胃癌腹腔转移过程并可能发挥重要作用。3. Cx43通过其组成的细胞间缝隙连接和(或)缝隙连接胞间通讯对胃癌细胞的生长、增殖、黏附、细胞周期、侵袭和迁移等生物学行为有明显影响。4. Cx43介导的缝隙连接在胃癌细胞腹腔转移过程中发挥重要作用,胃癌细胞与腹膜间皮细胞建立GJIC对于胃癌细胞突破腹膜间皮屏障是必需的;胃癌细胞与腹膜间皮细胞建立GJIC后,间皮细胞收缩,胃癌细胞从间皮细胞间连接间隙以“旁迁移”方式突破腹膜间皮屏障。