登革病毒(Dengue virus，DEN)作为世界上最重要的人类虫媒病毒之一已经威胁到热带和亚热带超过100个国家的25亿人口。登革病毒一般情况下导致登革热(dengue fever，DF)，但是部分病人可以进展为登革出血热(denguehemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome，DSS)。DHF和DSS的发病机制尚未清楚，一般认为主要是由于病毒和宿主相互作用而介导。DHF/DSS为重症的登革病毒感染，其主要的特征之一是血浆渗漏。DF进展到DHF/DSS的过程尚未阐明，目前普遍认为DHF/DSS发病机制包括登革血清型间的交叉免疫反应、病毒的毒力以及感染后产生的抗体依赖增强(ADE)效应在DHF/DSS的发生发展中具有重要的作用。一些免疫效应分子参与其病理机制。细胞因子水平尤其是肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)和一些化学介质的快速升高在DHF/DSS发病中起到了重要的作用，引起一系列相应的临床表现，如血浆外渗、休克、出血等。[2]而作为DHF/DSS发病中最重要的靶点——血管内皮细胞在登革病毒感染后又出现怎样的变化呢?为了更好地揭示这个问题，本课题组用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0芯片研究登革病毒感染血管内皮细胞后基因表达谱的变化。　　 基因芯片技术是伴随着人类基因组工程而兴起的一门崭新的技术，是一项专业基因分析技术，主要包括分析基因序列、检测基因突变和诊断疾病基因。基因芯片技术能够检测成千上万基因的表达水平。通过分析这些数据，我们能够全面了解登革病毒感染中各种基因表达的变化及其相应功能，为进一步研究这些基因与疾病之间的关系提供依据。[3]通过全面分析基因芯片结果，我们对登革病毒感染血管内皮细胞前后的基因表达变化有了全面和较为深刻的认识。　　 目的：　　 本研究旨在全面了解血管内皮细胞在登革病毒感染后基因水平的变化。　　 内容和方法：　　 1.原代人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的分离、培养、鉴定：　　 取新鲜脐带分离、培养原代HUVEC。采用Ⅷ因子抗原免疫组织化学技术鉴定所分离的细胞。用生长稳定，形态良好的第二至第四代细胞进行实验。　　 2.芯片实验：　　 通过总核糖核酸(RiboNucleic Acid，RNA)的提取和纯化，互补脱氧核糖核酸(Complementary Deoxyribonucleic acid，cDNA)的合成和纯化，体外转录(In Vitro Transcription，IVT)合成互补核糖核酸(Complementary RiboNucleicacid，cRNA)和cRNA的纯化，cRNA片段化、配制杂交液，芯片杂交，洗脱芯片，扫描芯片过程来完成芯片制作。　　 3.基因芯片数据分析：　　 采用专业芯片分析软件和相关网站对结果进行分析。　　 4.实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)实验：　　 通过设计引物，提取RNA，逆转录反应，荧光定量PCR等步骤来完成实时定量PCR的实验。　　 结果：　　 1.本研究共分离3个标本，每个标本均分为感染与未感染两个组，共6张芯片。采用配对t检验分析感染组与未感染组间差异筛选出干扰素-α诱导蛋白6(interferon，alpha-inducible protein6，IFI6)，干扰素诱导的跨膜蛋白1(interferoninduced transmembrane protein1，IFITM1)等共846个差异基因。目前有确定基因名称的共有556个，其中上升的有299个基因，下降的基因有257个基因。　　 2.经分析差异基因主要参与如下几条通路：促性腺激素释放激素信号通路，细胞外基质受体的相互作用，粘附途径，ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)运载体，长时程增效作用，白细胞迁移作用，谷氨酸代谢，钙信号通路，氮代谢通路。　　 3.经分析差异基因的基因本体(Gene Ontology，GO)富集于以下几个方面：免疫过程，免疫应答，配体依赖的核受体，终端纽，轴突组成部分，质膜组成部分，类固醇激素受体，体液平衡的调节。　　 4.实时定量PCR结果显示干扰素-α诱导蛋白27(interferon，alpha-inducible protein27，IFI27)，干扰素诱导蛋白44(interferon-induced protein44，IFI44)，IFITM1，干扰素诱导的17-KD蛋白(Interferon-induced17kDaprotein，ISG15)，IFI6这五个基因与芯片结果的趋势一致，均显示DEN感染组较未感染组表达升高。而在非差异基因的实时定量PCR结果中显示：X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor ofapoptosis associated factor1，XAF1)，信号转导与转录激活因子1(signal transducers and activators oftranscriptionl，STAT)这两个基因表现为感染组相对于未感染组呈上升趋势，细胞分裂周期蛋白20(cell division cycle20homolog，CDC20)，基质金属蛋白酶-14(matrix metallopeptidase14，MMP14)，小窝蛋白2(caveolin2，CAV2)这三个基因在实时定量结果中表达量均无大的变化。趋化因子(C-X-C基序)受体4(chemokine(C-X-C motif)receptor4CXCR4)，干扰素诱导蛋白p78(myxovirus resistance1，MX1)，干扰素调节因子7(Interferon regulatory factor7，IRF7)表达量过低，超出检测范围。　　 结论：　　 1.登革病毒感染HUVEC后可引起多个基因表达发生改变，其中干扰素诱导相关蛋白的基因表达有较大幅度的变化，这说明干扰素相关蛋白可能在登革病毒感染HUVEC过程中发挥了重要的作用。但由于干扰素诱导蛋白功能各异，其在登革病毒感染HUVEC过程中的作用极其复杂。　　 2.基因组芯片技术可以在人类全基因组水平上大规模筛选基因，是研究疾病发病机制的有力工具。