背景与目的 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV) 感染遍及世界各地，是威胁婴幼儿生命健康的病毒性肺炎和毛细支气管炎的主要病原体之一。出生后3个月的婴儿免疫功能不成熟是RSV严重感染和死亡的高峰期。人群对RSV普遍易感，到满24个月时所有的儿童至少感染过一次RSV，一半的儿童已经感染过两次，年龄越小病情越严重。感染后保护性免疫仅能持续数月，再感染经常发生。长期反复感染可致婴幼儿未来肺功能的慢性异常变化。与日后发生反复喘息和哮喘密切相关。目前尚无安全有效的疫苗和药物控制RSV感染。RSV为单股负链RNA病毒，其序列已清楚。其中的M2基因编码病毒复制中所需的病毒多聚酶，在RSV基因表达中起关键作用。研究人员在M2 mRNA上找出了3个可以作为反义寡核苷酸作用位点，并在细胞内证实了针对这些序列设计的反义寡核苷酸抗病毒活性最强。脱氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme)是使用体外分子进化技术，从一个人工合成的随机多核苷酸单链DNA库中筛选出具有酶活性的DNA分子。其发现是人类对于酶的认识的又一次飞跃。一种通用于RNA切割的脱氧核酶分子10-23由两侧与底物互补的识别臂和中间的<WP=6>内切酶活性的碱基环构成。该脱氧核酶能在模拟生理条件下切割几乎任何包含嘌呤-嘧啶的RNA，与核酶相比脱氧核酶分子量小、酶切效率高，对化学和酶的降解敏感性低，这些特点赋予它在体外和体内应用的巨大潜能。脱氧核酶的应用研究在肿瘤、心血管疾病及病毒感染性疾病方面取得了不同程度的进展。本实验室根据RSV基因组RNA保守序列NS1-NS2区域及转录中间产物M2 mRNA设计了六种脱氧核酶，在体外无细胞系统和细胞培养系统中筛选出了具有高效和特异的RNA分解酶活性的脱氧核酶。本研究使用筛选出的M2 RNA的脱氧核酶DZ8269在感染RSV的小鼠体内应用，观察其在体内对RSV复制的影响，为使用脱氧核酶控制RSV感染提供理论依据。方法: 给小鼠感染不同负荷量RSV，并于小鼠感染106PFU RSV后不同时间取右肺组织作空斑形成实验检测肺组织RSV滴度，左肺组织固定后进行ICAM-1免疫组化和原位杂交法及HE染色进行病理检测，并进行电镜检查。外科分离暴露小鼠气管，经气管内注入墨汁；将小鼠固定只露出鼻孔，用高频雾化器雾化墨汁使其吸入或将小鼠浅麻醉后鼻内滴入墨汁。处死小鼠取肺组织进行肺内给药方法的比较。选取104 PFU RSV为以后脱氧核酶试验用。小鼠于感染后每隔12小时鼻内滴入同体积不同量的胆固醇修饰的脱氧核酶，共给两次药。随后每天观察小鼠的一般状况，并处死小鼠取右肺作空斑形成实验，左肺组织固定后进行ICAM-1免疫组化和HE染色进行病理检测，并行RSV G<WP=7>mRNA的RT-PCR。结果：RSV病毒感染量为103 PFU时肺组织无空斑形成，当感染104PFU以上的RSV时，肺内病毒随着感染病毒量增多而增多。给鼠感染106 PFU后，病毒在肺内复制后随着时间推移量逐渐降低，感染第7天的肺组织已无空斑形成。病理显示RSV感染第3天肺组织炎症性变化即明显，感染第7天肺部炎症细胞减少，但出现部分肺泡壁断裂融合，肺泡腔扩大，淋巴细胞浸润于细支气管与血管周围明显。原位杂交证实RSV主要侵袭支气管、细支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞。免疫组化显示RSV感染组小鼠肺组织细胞间粘附分子（ICAM-1）与对照相比在肺泡壁内皮细胞表达增强。鼻内滴入适量药物可以进入下呼吸道，对小鼠影响较小。给感染RSV的小鼠用0.8mg以下的脱氧核酶对小鼠的一般状况及肺组织病理与RSV感染小鼠相比无明显改变。当接种2mg脱氧核酶时小鼠体重、活动度均降低，皮毛凌乱，缩成一团，消瘦，肺组织炎症加重。空斑试验表明0.4mg以上的脱氧核酶在小鼠体内能抑制RSV的复制，抑制程度与脱氧核酶的量呈正比。肺组织RSV G mRNA的RT-PCR显示脱氧核酶能抑制G基因的表达。3’末端胆固醇修饰的脱氧核酶抗病毒效果要比无修饰的脱氧核酶和胆固醇修饰的反义寡核苷酸抗RSV效率高。结论：3’末端胆固醇修饰的脱氧核酶DZ8269在安全剂量下能抑制在小鼠体内呼吸道合胞病毒的复制。其效率高于同靶位点的反义寡核苷酸。提示脱氧核酶对控制人类RSV感染具有潜在的使用价值。