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【目的】了解同时高产AmpC酶和/或ESBLs酶的阴沟肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药表型和耐药模式,以及对β-内酰胺类以外抗生素的耐药机制。【方法】(1)采用琼脂平皿二倍稀释法测定14株同时高产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌对21种抗生素的耐药表型(MIC)。(2)应用聚合酶链反应(PCR)对14株同时高产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌gyrA及parC基因进行扩增、测序并与野生型大肠杆菌相对应的gyrA及parC基因QNDR核苷酸序列进行比较分析。(3)采用PCR对25株产ESBLs酶的阴沟肠杆菌进行qnrA、qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib-cr基因的扩增和测序。(4)采用PCR方法对14株同时高产AmpC酶和ESBL酶的阴沟肠杆菌3类整合酶基因进行扩增和测序,对整合子可变区进行扩增和测序。(5)采用PCR方法对14株同时高产AmpC和ESBLs酶的阴沟肠杆菌进行AMEs和16S rRNA甲基化酶基因检测。【结果】(1)对14株同时高产AmpC酶和ESBLs的阴沟肠杆菌,碳青霉烯类抗菌活性最强,敏感率100%,氨苄西林/舒巴坦、头孢西丁、第三代头孢菌素和氨曲南耐药率均为100%,哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和头孢吡肟敏感率均为0%,耐药率(不包括“中敏”-Ⅰ)分别为50%、85.71%、85.71%,氨基糖甙类和喹诺酮类敏感率在12.50-25%之间。85.71%的上述阴沟肠杆菌表现为多重耐药,对3-5组抗菌药物耐药。(2)14株高产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌gyrA基因和parC基因喹诺酮耐药决定区扩增和序列分析结果表明:78.58%(11/14)菌株gyrA基因在83位氨基酸(TCC→TTC,Ser→Phe)和87位氨基酸密码子(GAC→GCC,Asp→Ala)发生了改变,7.14%(1/14)菌株83位氨基酸密码子发生了改变(TCC→TAC,Ser→Tyr),71.43%(10/14)阴沟肠杆菌ParC蛋白80位氨基酸密码子发生了突变(AGC→ATC,Ser→Ile),71.4%(10/14)菌株GyrA和Parc蛋白均存在氨基酸改变,12株喹诺酮类耐药菌株在GyrA、ParC蛋白的QRDR有1-3个氨基酸改变,2株敏感阴沟肠杆菌没有氨基酸改变。(3)25株产ESBLs酶阴沟肠杆菌qnrA基因阳性率4%,qnrB2基因阳性率16%,与阴沟肠杆菌(登录号EU131184)qnrB2基因核苷酸序列同源性为86%,有6个氨基酸发生了改变,没有发现qnrS基因和aac(6’)-Ib-cr基因,100%qnr基因阳性阴沟肠杆菌均产SHV-12型ESBLs。80%(4/5)qnr基因阳性阴沟肠杆菌对环丙沙星、左旋氧氟沙星、氧氟沙星和加替沙星表现为敏感,20%(1/5)表现为敏感性下降,5株qnr阳性阴沟肠杆菌gyrA和parC基因没有发生突变。(4)aac(6’)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、ant(3’)-Ⅰ和ant(2’)-Ⅰ基因扩增阳性率分别为85.71%、21.43%、78.57%和14.29%,没有发现aac(6’)-Ⅱ、aac(3)-Ⅰ和aph(3″)-Ⅵ基因。16s rRNA甲基化酶armA基因阳性率为78.57%(11/14),其中90.90%(10/11)阴沟肠杆菌产CTX-M-3型ESBLs,9.1%的阴沟肠杆菌产SHV-12型ESBLs,没有发现rmtB和rmtC基因。16S rRNA甲基化酶armA基因阳性阴沟肠杆菌对庆大霉素、丁胺卡那、妥布霉素和奈替米星均表现出高水平耐药(MICs＞256μg/ml)。(5)85.71%(12/14)高产AmpC和ESBLs酶阴沟肠杆菌含有Ⅰ类整合子,没有检测到Ⅱ和Ⅲ类整合子。78.57%(11/14)菌株Ⅰ类整合子可变区扩增阳性。最常见的是编码对氨基糖甙类耐药基因盒aadA和甲氧氨胺嘧啶耐药基因盒dfrA。扩增子为2121bp的1株菌含有2个基因盒dfrA12-aadA2,dfrA12编码二氢叶酸还原酶12,对甲氧苄氨嘧啶耐药,aadA2编码氨基糖甙腺苷转移酶A2,对链霉素和大观霉素耐药,其中dfrA12和dfrA12-aadA2基因盒排列首次在阴沟肠杆菌中发现。扩增子为1865bp的1株菌含有2个基因盒dfrA17-aadA5;扩增子为1776bp的1株菌含有2个基因盒dfrA16-aadA2;扩增子为1236bp的1株菌含基因盒aadA4,其中aadA4是首次在阴沟肠杆菌中发现的。6株扩增子为1194bp的阴沟肠杆菌含基因盒aadA2;扩增子为962bp的1菌株含基因盒aadB,编码氨基糖甙(2”)-O-腺苷酰基转移酶,对妥布霉素、庆大霉素和卡那霉素耐药。【结论】(1)同时高产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌,绝大多数为多重耐药菌株,碳青霉烯类体外抗菌活性最强,第三代头孢菌素、第四代头孢菌素和β-内酰胺类/酶抑制剂1 00%不敏感,氨基糖甙类和喹诺酮类仅对少数菌株(10.25%-25%)敏感。(2)阴沟肠杆菌DNA旋转酶亚单位GyrA 83位氨基酸Ser、87位氨基酸Asp改变是对喹诺酮类耐药的主要机制,单个Ser→83氨基酸改变就可以引起对氟喹诺酮耐药。(3)产ESBLs酶的阴沟肠杆菌qnr基因的流行率为20%,100%qnr基因阳性菌株与SHV-12型ESBLs相关联。qnr基因阳性阴沟肠杆菌对喹诺酮类表现敏感或仅为敏感性下降,qnr阳性菌株gyrA和parC基因QRDR核苷酸序列没有发生基因突变。(4)产氨基糖甙类修饰酶aac(6’)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、ant(3’)-Ⅰ、ant(2’)-Ⅰ和16S rRNA甲基化酶armA是阴沟肠杆菌耐氨基糖甙类的主要机制,16S rRNA甲基化酶armA基因阳性菌株对庆大霉素、丁胺卡那、妥布霉素和奈替米星均表现出高水平的耐药(MICs＞256ug/ml)。16S rRNA甲基化酶armA基因与CTX-M-3型和SHV-12型ESBLs相关联。(5)Ⅰ类整合子在阴沟肠杆菌耐药基因传播中起主导地位,最常见的耐药基因型是编码对氨基糖甙类耐药的基因盒(aadA2、aadA4和aadA5)和对甲氧氨胺嘧啶耐药的基因盒dfrA(dfrA12、drfA16和dfrA17)。