炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种慢性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克隆病(Crohn’s disease，CD)。IBD在发达国家中非常常见，每10万人中就有100-200个患者，远高于亚洲和非洲地区。我国IBD的发病率也在逐年递增。但现有的药物和外科手术治疗 IBD的效果均不显著，且带来许多的不良反应。因此，寻找预防和治疗IBD的新制剂并阐明其作用机制成为目前IBD研究领域亟待解决的问题。　　CD的发病机制目前仍不完全清楚，但免疫因素在其中起着重要作用。三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS）诱导的小鼠结肠炎模型因其与CD的临床发病特点类似，并且建模过程操作简单、重复性好，成为研究IBD的一种经典动物模型。一系列研究表明，蠕虫感染可减少免疫性疾病如糖尿病、多发性硬化和克隆病的发生。而其中生命周期长、组织内寄生的血吸虫及其免疫活性产物在多种自身免疫性疾病中显示出较强的免疫调节功能和保护作用。有研究显示，曼氏及日本血吸虫虫卵均可对TNBS诱导的实验性结肠炎产生保护作用。但迄今为止，日本血吸虫虫卵对于TNBS诱导的小鼠结肠炎整个病程的免疫调节作用尚无报道。　　虽然血吸虫虫卵可对TNBS诱导的实验性结肠炎产生保护作用，但其发挥保护作用的具体机制仍有待深入阐明。新近研究表明，多种自身免疫性疾病患者体内，包括风湿性关节炎（RA）和多发性硬化（MS）等，存在Treg/Th17免疫失衡；并且Treg/Th17免疫失衡在 IBD炎症发生中起着重要的作用。有研究显示，曼氏血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）可上调Ⅰ型糖尿病模型中Treg细胞的比例。另有研究报道，曼氏血吸虫SEA在诱导结肠炎小鼠体内Tre g效应细胞因子TGF-β及IL-10表达，同时可抑制Th17细胞的效应细胞因子IL-17的分泌。以上研究提示，血吸虫对结肠炎的保护作用，不仅与Treg有关，而且与Th17的作用有关，但寄生虫感染是否通过调控Treg/Th17的平衡来干预IBD的发生尚未见报道。　　因此，本课题首先观察了日本血吸虫虫卵对小鼠结肠炎整个病理进程的免疫调节作用，接下来在证实TNBS诱导的小鼠结肠炎中存在Treg/Th17失衡的基础之上，进一步探讨Treg/Th17平衡在日本血吸虫虫卵免疫调节小鼠结肠炎中的作用，从而为阐明血吸虫虫卵对结肠炎保护作用的免疫学机制奠定实验基础。　　本课题分为以下二个部分:　　一、日本血吸虫虫卵对TNBS诱导的小鼠结肠炎的免疫调节作用　　1.本实验采用 TNBS建立小鼠急性结肠炎模型，观察和记录小鼠的一般症状、体重、结肠组织局部炎症以及生存率改变。结果发现，和正常对照组相比，TNBS诱导的结肠炎小鼠出现了竖毛、少动和粘液血便等一般肠炎症状。在造模后第1天小鼠体重下降了8％，第3天开始回升，但至造模后第7天依然明显低于正常对照组。实验还发现，在造模后的第3天和第5天小鼠结肠组织局部炎症明显，但在造模后第7天逐渐缓解。另外，在造模后第3天小鼠生存率降到低峰，至造模后第5天已降到30%，并进入平台期。以上研究结果表明，TNBS诱导的小鼠结肠炎模型建立成功。　　2.接下来，我们观察日本血吸虫虫卵对 TNBS诱导的小鼠结肠炎不同时间点的影响。结果发现，与结肠炎对照组相比，在造模后的第3天，提前给予日本血吸虫虫卵免疫会加重结肠炎小鼠粘液血便等一般症状，但在造模后第5天和第7天可明显减轻这些症状。另外，在造模后第1到3天其体重下降更快，但在造模后第5到7天回升更快，并接近正常水平。结果提示，日本血吸虫虫卵在造模后第3天会加重结肠组小鼠的体重丢失，但在造模后第5天和第7天均可促进结肠炎小鼠的体重快速恢复。此外，提前给予日本血吸虫虫卵免疫在造模后第3天加重结肠组织局部炎症，但在造模后第5天和第7天均可减少小鼠结肠组织局部炎症反应。因此，本实验中血吸虫虫卵对小鼠结肠组织局部炎症反应的免疫调节作用，与其对结肠炎组小鼠体重变化的影响时间趋势基本一致。虫卵免疫结肠炎组在造模后的第5天和第7天的生存率均达到90%，显著高于结肠炎组。上述结果说明，日本血吸虫虫卵在TNBS造模后的第5天和第7天可通过减轻小鼠结肠炎的炎症反应改善结肠炎小鼠的一般症状和体重，提高结肠炎小鼠生存率。在TNBS造模后的第3天尽管会加重结肠炎小鼠的一般症状和局部炎症反应，但对结肠炎的小鼠生存率没有影响。　　二、Treg/Th17平衡在日本血吸虫虫卵免疫调节TNBS诱导的小鼠结肠炎中的作用1.本实验首先采用流式细胞术检测了各组小鼠脾脏中Treg和Th17细胞比例的动态变化，并计算不同时间点Treg/Th17比例。结果发现，TNBS诱导的结肠炎小鼠脾脏中Treg细胞比例虽然在造模后的第3天轻度增高，但在造模后第5和第7天其比例均降低。脾脏中Th17细胞比例在造模后的第3天明显升高，之后开始下降，至造模后第7天降至正常水平。脾脏中Treg/Th17细胞比例在造模后第3天明显低于正常对照组，并随病程延长持续降低，提示TNBS诱导的结肠炎小鼠脾脏中存在Treg/Th17失衡。此外，结肠炎小鼠脾脏中Treg/Th17细胞的比例变化趋势同小鼠结肠组织炎症的严重程度呈明显负相关（R2=-0.88）。　　2.在证实了TNBS诱导的小鼠结肠炎中存在Treg/Th17免疫失衡的基础之上，本课题接下来研究日本血吸虫虫卵是否是通过调控Treg/Th17的免疫平衡从而达到对小鼠结肠炎的免疫调节作用。结果显示，与结肠炎对照组相比，预先给予日本血吸虫虫卵在造模后第3天可下调结肠炎小鼠脾脏中Tre g细胞比例，同时上调脾脏中Th17细胞比例；在造模后第5天，则明显下调脾脏中Th17细胞比例；至造模后第7天虫卵免疫的结肠炎小鼠脾脏中Treg细胞比例明显升高而Th17细胞显著下降。因此，单用Treg或Th17都不足以解释血吸虫虫卵对小鼠结肠炎的免疫调控作用。计算Treg/Th17细胞比例，结果显示，Treg/Th17的比例在造模后的第3天明显下调，但在造模后第7天显著升高。另外，我们采用Western Blot及免疫组织化学法检测了虫卵对结肠炎小鼠结肠组织中Treg细胞特异性核转录因子Foxp3和Th17细胞特异性核转录因子RORγt蛋白水平表达的影响。结果发现，日本血吸虫虫卵在造模后第3和第5天会抑制结肠炎小鼠结肠组织中Foxp3蛋白的表达，但之后可促进其表达量的升高；RORγt蛋白的表达在造模后第3天增高，而在造模后第5和第7天其蛋白表达显著降低。以上结果说明，血吸虫虫卵不仅对Tre g和Th17细胞的比例产生影响，还可调节Treg和Th17细胞的活化状态。ELISA检测小鼠脾细胞培养上清和外周血中Treg细胞的效应细胞因子（TGF-β和IL-10）和Th17细胞的效应细胞因子IL-17A的水平。结果显示，虫卵在造模后第5和第7天明显的促进了脾细胞培养上清中TGF-β的表达。虽然在造模后第3天上调结肠炎小鼠脾脏和外周血中IL-17A的含量，而从造模后第5天开始，则明显抑制了外周血和脾细胞培养上清中IL-17A的水平。因此，血吸虫虫卵对结肠炎的免疫调节作用与其逆转结肠炎小鼠体内的Treg/Th17免疫失衡效应密切相关。　　综上所述，本课题的研究结果为：　　1．阐明了日本血吸虫虫卵对TNBS诱导的小鼠结肠炎整个病程的免疫调节作用，表现为：日本血吸虫虫卵在TNBS造模后的第5天和第7天可通过减轻小鼠结肠炎的炎症反应，改善结肠炎小鼠的一般症状和肠道炎症，促进体重恢复，从而提高结肠炎小鼠生存率。但在TNBS造模后的第3天，预先给予血吸虫虫卵尽管会加重结肠炎小鼠的一般症状和局部炎症反应，但对结肠炎小鼠生存率没有影响。　　2.本实验初步阐明TNBS诱导的实验性结肠炎小鼠体内存在Treg/Th17免疫失衡，并且这种免疫失衡与TNBS诱导的结肠组织的炎症反应密切相关。同时，日本血吸虫虫卵的预先给予在造模后第5和第7天可以逆转结肠炎小鼠体内Treg/Th17的免疫失衡，这种免疫调节作用表现为上调Treg数量、促进Treg细胞的活化以及其效应细胞因子TGF-β的表达，同时下调Th17数量、抑制Th17细胞的活化以及其效应细胞因子IL-17的表达，从而发挥其对结肠炎的免疫保护作用。