目的：葡萄糖调节蛋白78（GRP78），又称免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP），是热休克蛋白70（HSP70）家族的重要成员。GRP78最初被发现在内质网中作为分子伴侣，对蛋白质的正确折叠组装起着重要作用，而在肿瘤细胞中GRP78可以被诱导表达，进而促进肿瘤细胞的增殖、抗凋亡以及增加肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。近来发现GRP78不仅存在于细胞内内质网中，也可以转移到细胞膜甚至可以分泌到细胞外，而分泌型GRP78作为肿瘤微环境的组成部分对肿瘤的作用还不完全清楚。结合实验室前期研究基础，GRP78对免疫细胞特别对树突状细胞的生长分化具有重要的调节作用。本研究探讨肿瘤细胞分泌的GRP78作为肿瘤微环境的组成部分，对肿瘤微环境中巨噬细胞产生的影响。　　方法：⑴利用PMA可以促进单核细胞THP1向巨噬细胞分化这一研究模型，研究GRP78对巨噬细胞极化的影响。提取纯化原核表达蛋白GRP78与丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）共同刺激单核细胞THP1，并分组设立GRP78浓度梯度10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml，刺激72h后收集细胞用流式细胞仪检测细胞表面标志CD163、FGL2。用Trizol提取细胞的RNA，利用RT-PCR方法检测FIZZ1、IL10、TGFβ、ARG1和iNOS等分子的RNA表达。⑵设计与GRP78编码序列互补的引物对，引入Xho I和Hind III酶切位点，取实验室前期构建的人来源GRP78原核表达载体pGEX-4T-3-GRP78为模板，PCR扩增人GRP78基因(去内质网滞留信号中的KDEL序列）；将GRP78基因片段及PET42a空载质粒均用Xho I和Hind III酶切处理后经琼脂糖凝胶电泳，回收带有相同黏性末端的片段用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，并挑取阳性菌落扩增提取质粒酶切鉴定，将酶切正确的质粒送公司测序，保留测序正确的质粒pET-42a-GRP78及菌种。同理，设计与GRP78编码序列互补的引物对，引入6个His标签及Pst I和BamH I酶切位点，以前述pET42a-GRP78载体为模板，扩增目的基因。GRP78基因片段及pIRES2-EGFP空载质粒均用Pst I和BamH I酶切处理后回收带有相同黏性末端的片段，用 T4连接酶连接,其他实验步骤如前述，测序后保存pGIE质粒及菌种。⑶提取pGIE质粒，用Pst I限制性内切酶将质粒线性化并凝胶电泳回收。用Lipofectamine2000转染试剂将回收的质粒转染前列腺癌细胞DU145，用G418进行抗性筛选并进行单克隆化，在荧光显微镜下观察挑选出带有绿色荧光的细胞进行扩大培养，并进行多次传代培养。对稳定带有荧光的细胞，进一步进行流式细胞术鉴定，并用Elisa检测细胞上清中GRP78的分泌。选取分泌GRP78的细胞进行保存培养及后续的实验。　　结果：①GRP78刺激单核细胞THP1后，FCM检测显示CD163表达升高，且随着GRP78刺激浓度升高而增加，RT-PCR检测显示在GRP78浓度为40ng/ml时FIZZ1、TGFβ有明显的升高，FGL2的表达则随着GRP78浓度的增加而降低，而IL10、ARG1、iNOS的表达变化不明显。②目的基因片段与pIRES2-EGFP空载体连接后，挑取筛选后蓝白斑阳性菌落扩增并提取质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定筛选出质粒大小符合理论值（约7kb）的质粒，酶切后电泳鉴定进一步筛选出符合预期大小的质粒样品，测序结果与GRP78-?KDEL基因序列相符，所编码氨基酸序列完全一致，结果表明pGIE真核核表达载体构建成功。③在荧光显微镜下，观察转染pGIE质粒的DU145细胞形态及绿色荧光的表达，选取荧光强度较强的细胞进行单克隆化并继续G418加压筛选，选取荧光强度强的细胞扩大培养，并用流式细胞仪进行绿色荧光检测，收集转染以及未转染质粒的细胞上清ELISA检测，ELISA检测结果显示转染了pGIE质粒的DU145细胞上清中GRP78较未转染的有明显升高。　　结论：⑴GRP78可以促进单核细胞THP1表面CD163、FIZZ1、TGFβ分子的表达，而抑制FGL2的表达，提示GRP78可以促进THP1细胞向M2型巨噬细胞极化；⑵成功构建编码缺失内质网滞留信号KDEL并融合HIS标签的GRP78的真核表达载体pGIE；⑶成功建立具有稳定分泌GRP78-HIS功能的DU145细胞系。