目的：建立体外培养体系，培养精原细胞，为精原干细胞研究提供实验模型；在雄激素的作用下，观察精原细胞在体外分化过程中的变化，以了解精子发生中睾丸支持细胞以及雄性激素在精原细胞分化中所起的作用，为阐明精子发生所依赖的微环境提供实验依据。 方法：①饲养单层的制备：选取7-8天左右雄性小鼠，抽吸股骨骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells，BMSC)做原代培养3-4天，待基质细胞伸出长突起、相互交织形成单层细胞并铺满瓶壁面积达70％时，用含10μg/ml丝裂霉素C的IMDM培养基处理1.5小时，充分清洗后作为饲养层备用；②睾丸支持细胞的分离纯化：在无菌条件下剖腹取出7-8天左右雄性小鼠双侧睾丸，经组合酶消化，在镜下监测，待生精小管基本解离成单个细胞团时，用含血清的IMDM终止消化，离心弃去上清液，将细胞悬液平均接种在25ml的培养瓶中，瓶中预先放有0.1％多聚赖氨酸处理过的盖玻片，调整细胞密度为3×105个/ml，置37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养，4小时后换液加入培养基继续培养,24小时后，每瓶加入1.5ml20mmolTris-HCL液低渗处理3分钟，D-Hanks液清洗3次，加入培养基在同上条件下培养，待支持细胞融合成片时及时传代，平均接种于六孔板中。③接种精原细胞：同法取7-8天左右雄性小鼠睾丸，按上述酶消化过程制备精原细胞悬液，并将悬液接种在制备好的BMSC饲养层上，置于34℃，5％CO2饱和湿度条件下共培养，72小时后，以特制的内径50-100μm的毛细玻璃弯管在倒置相差显微镜下将精原细胞克隆球吸出，吹打均匀后加入胰酶，制成单细胞悬液，平均分配到六孔板中与睾丸支持细胞共同培养。④加入丙酸睾丸素：设置实验组和空白对照组，在实验组的共培养体系中加入不同剂量的丙酸睾丸素，浓度分别为0.1μmol/L；0.2μmol/L；0.5μmol/L；1.0μmol/L；1.5μmol/L，同时培养BMSC作为流式细胞仪二倍体内部参照组。⑤检测：在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化并照相；对培养的精原细胞进行碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)染色、c-kit受体检测；对培养的支持细胞进行H&E染色、油红染色；对空白组和实验组，运用流式细胞仪进行DNA倍性分析，了解各组的单倍体细胞率。 结果：①精原细胞在BMSC饲养层上克隆生长，培养72小时，细胞增殖达到高峰，形成4-16个，甚至32个由细胞间桥相连成串的细胞团，细胞表达c-kit受体阳性,ALP染色阳性。②经分离纯化得到了高纯度的睾丸支持细胞，镜下观察呈不规则的多边形，胞质中见空泡，油红染色呈橘黄色，提示为脂质小体；③精原细胞与支持细胞共培养，在丙酸睾丸素的作用下，不同的浓度组均表现出向子代分化的趋势，但各组的分化率不同，经流式细胞仪分析，以0.5μmol/L组分化率最高，经四格表χ2检验差异具有显著性(P＜0.01)。 结论：①精原细胞和睾丸支持细胞的共生性培养，可使这些细胞在培养过程中重新建立起联系并进行增殖，能成功地为精原细胞体外纵向诱导分化的研究提供细胞实验模型。②雄性激素是精原细胞分化微环境中的重要物质，体外培养的精原细胞在不同浓度的丙酸睾丸素的作用下均表现出向子代分化的趋势，但各组的分化率不同，以0.5μmol/L为最佳浓度。