钩吻素子具有重大新药开发价值,但其作用靶点以及作用方式有待研究。转运蛋白（18 kDa）[translocator protein（18 kDa）,TSPO],有望成为治疗神经精神疾病等疾病重要的药物作用靶点。本课题组先前和同期研究提示,钩吻素子对TSPO可能存在正性别构调节作用,但有待于论证。近年来,人们日益重视免标记的生物分子间相互作用技术的应用,其中表面等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）技术作为一种新型的免标记、实时在线研究生物分子间相互作用的高灵敏传感技术,可实时动态分析药物对膜蛋白的亲和力和相互作用的动力学变化,已应用于别构调节的研究,与放射配体结合分析法可相互印证,并弥补后者需要同位素标记的内源性配体的局限性。鉴此,本文首先采用分子对接分析TSPO与钩吻素子是否存在结合的可能。在此基础上,建立SPR技术,检测钩吻素子与TSPO结合的亲和力,探索钩吻素子能否增强TSPO正位配体与人源TSPO重组蛋白、鼠源TSPO重组蛋白的亲和力,从化学生物学角度进一步论证钩吻素子对TSPO存在别构调节。主要研究内容如下:1.分子对接分别计算PK11195、钩吻素子与TSPO的亲和力基于分子对接技术,用AutoDock程序计算TSPO与其配体PK11195亲和力大小。分子对接技术结果显示,配体PK11195与TSPO亲和力57.31μM,主要通过范德化力、疏水作用进入蛋白的活性中,活性中心处的PRO18,ALA19,THR20,THR21,GLY22,ALA23,LEU25,LYS26,PRO27,ARG43,TRP44,PHE46,PRO47,TRP50,THR51,THR54,PHE92等氨基酸与PK11195相互作用。钩吻素子与TSPO亲和力为25.34μM,主要通过范德化力、疏水作用进入蛋白的活性中,TSPO活性中心处的GLY22,ALA23,LEU24,LEU25,LYS26,PRO27,ARG43,TRP44,PHE46,PRO47,TRP50,PHE92等氨基酸与钩吻素子相互作用。2.钩吻素子对人源TSPO重组蛋白与其正位配体亲和力的影响2.1钩吻素子及TSPO正位配体与人源TSPO重组蛋白的亲和力采用SPR技术,通过在CM5芯片上氨基偶联人源TSPO重组蛋白,测得TSPO外源性配体PK11195、外源性配体Ro5-4864、内源性配体PPIX与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值分别为199.77±0.12μM、176.93±2.70μM、156.93±5.50μM,进一步检测钩吻素子与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值为155.33±11.0μM。2.2测定钩吻素子对人源TSPO重组蛋白与其正位配体亲和力的影响分别依次测定运行缓冲液中含有10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-33 M钩吻素子时,浓度为0.1 K_D值即20.0μM PK11195、17.7μM Ro5-4864、15.7μM原卟啉IX二钠盐流过蛋白固定通道和参比通道时的响应信号。结果显示当钩吻素子浓度分别为10^-5、10^-7与10^-6 M时,PK11195、Ro5-4864及PPIX与TSPO相互作用的响应值达到最大值。采用多循环动力学检测在10^-5 M钩吻素子存在的条件下,PK11195与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值为95.27±0.62μM,对比运行缓冲液不含钩吻素子的PK11195与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值,钩吻素子能够明显增强PK11195与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值,有统计学意义（P<0.001）;10^-77 M钩吻素子存在的条件下,Ro5-4864与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值为77.73±0.87μM。对比运行缓冲液不含钩吻素子的Ro5-4864与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值,钩吻素子能够明显增强Ro5-4864与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值,有统计学意义（P<0.001）;10^-66 M钩吻素子存在的条件下,测得PPIX与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值为66.07±3.32μM。对比运行缓冲液不含钩吻素子的PPIX与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值,钩吻素子能够明显增强PPIX与人源TSPO重组蛋白结合的K_D值,有统计学意义（P<0.001）。3.钩吻素子对鼠源TSPO重组蛋白与其正位配体亲和力的影响3.1钩吻素子及TSPO正位配体与鼠源TSPO重组蛋白的亲和力通过原核表达获得鼠源TSPO重组蛋白,经Ni²⁺亲和色谱柱纯化蛋白并通过Western blot对蛋白进行初步表征。利用SPR技术,通过捕获带有His标签的鼠源TSPO重组蛋白来固定蛋白。测定TSPO外源性配体PK11195、TSPO外源性配体Ro5-4864、TSPO内源性配体PPIX与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值分别为161.33±6.1μM、169.75±6.07μM、95.85±4.36μM,进一步检测钩吻素子与鼠源重组TSPO蛋白结合的K_D值为97.37±1.76μM。3.2测定钩吻素子对鼠源TSPO重组蛋白与其正位配体亲和力的影响分别依次测定运行缓冲液中含有10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-33 M钩吻素子时,浓度为0.1K_D值即16.1μM PK11195、17.0μM Ro5-4864、9.6μM原卟啉IX二钠盐流过鼠源TSPO重组蛋白固定通道和参比通道时响应信号。结果显示当钩吻素子浓度分别为10^-7、10^-6与10^-77 M时,PK11195、Ro5-4864及PPIX与鼠源TSPO重组蛋白相互作用的响应值达到最大值。采用多循环动力学检测在10^-7 M钩吻素子存在的条件下,PK11195与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值为95.32±1.80μM,对比运行缓冲液不含钩吻素子的PK11195与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值,钩吻素子能够明显增强PK11195与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值,有统计学意义（P<0.001）;10^-6M钩吻素子存在的条件下,Ro5-4864与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值为67.68±11.09μM。对比运行缓冲液不含钩吻素子的Ro5-4864与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值,钩吻素子能够明显增强Ro5-4864与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值,有统计学意义（P<0.001）;10^-77 M钩吻素子存在的条件下,测得PPIX与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值为39.87±3.87μM。对比运行缓冲液不含钩吻素子的PPIX与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值,钩吻素子能够明显增强PPIX与鼠源TSPO重组蛋白结合的K_D值,有统计学意义（P<0.001）。4.钩吻素子对TSPO正位配体与鼠源TSPO脂蛋白体亲和力的影响结合相关文献,我们首次利用SPR技术,采用芯片表面重构的方法研究PK11195及钩吻素子与鼠源TSPO脂蛋白体亲和力。测得PK11195与鼠源TSPO重组蛋白的K_D值为8.04±1.42 nM,进而检测钩吻素子与鼠源TSPO重组蛋白的K_D值为0.61±0.11 nM。后期工作将用表面重构法继续测定钩吻素子对于TSPO正位配体与TSPO亲和力的影响。本文研究结果提示,可用SPR技术检测钩吻素子以及TSPO正位配体与TSPO结合的亲和力,分析钩吻素子对TSPO正位配体与TSPO蛋白亲和力的影响;钩吻素子可显著增强TSPO正位配体PK11195、Ro5-4864或PPIX与TSPO的亲和力,提示钩吻素子对TSPO存在正性别构调节。