论文部分内容阅读
一、研究背景垂体腺瘤（pituitary adenomas,PA）在脑肿瘤中占比约为10-15%,是神经外科肿瘤中的多见类型。2017年WHO PA分类强调了对肿瘤增殖潜能的病理评估,以识别临床侵袭性腺瘤。随着增殖活性的增强,部分PA病例逐渐表现出局部快速生长、肿瘤扩散等恶性特征,手术全切困难,容易早期复发,进而导致不良预后。目前WHO尚未对此类PA进行的具体定义和分类,部分学者将其命名为“高增殖指数PA”（high proliferation index PA,HI-PA）。因此,开发新的治疗策略来降低PA的增殖指数以改善患者的预后是至关重要的。代谢变化与肿瘤发生密切相关,是肿瘤的标志之一。细胞代谢重编程是肿瘤的一个重要特征。大多数PA中存在异常的激素分泌,导致显著的代谢重编程。反过来,这些代谢改变也可能会影响PA的发生发展。在课题组前期研究中,已证实乳酸脱氢酶在调节PA异常葡萄糖代谢中发挥的作用。线粒体作为葡萄糖代谢的重要细胞器,通过氧化磷酸化（oxidative phosphorylation,OXPHOS）在肿瘤细胞能量供应中发挥着关键作用。线粒体不仅为肿瘤合成代谢、控制氧化还原和钙稳态提供基础,而且还参与调控致癌转录和肿瘤细胞死亡。因此,在各种肿瘤的研究中,靶向线粒体是探索新型抗肿瘤治疗的有前景的方向。然而,有关线粒体代谢在PA发展中所发挥作用的研究相对较少。线粒体分裂和融合的平衡是维持线粒体健康、调节细胞代谢的重要生理过程。这种平衡由众多分子调控,动力相关蛋白1（Dynamin-related protein 1,Drp1）就是核心分子之一,它在诸多哺乳动物细胞中承担着调节线粒体分裂的关键任务,介导了细胞内代谢产物的更新和再分配。Drp1已被证明在多种肿瘤类型中影响肿瘤进展。然而,Drp1是否能通过直接调控线粒体代谢来影响PA的进展尚不清楚。二、研究目的观察Drp1在调节PA线粒体代谢稳态和PA生长中所发挥的作用,并探讨相关作用的机制,为临床靶向线粒体代谢治疗PA提供实验室依据。三、研究内容1.比较Drp1在不同增殖指数的PA临床手术标本中的表达量差异。2.在野生型PA细胞株、大鼠垂体腺瘤GH3细胞株Drp1过表达（overexpression,OE）稳转细胞模型和裸鼠荷瘤模型中,观察Drp1对PA细胞增殖能力和凋亡率的影响。3.在PA细胞株中观察Drp1对GH3细胞线粒体结构功能的影响并据此探索Drp1调节细胞增殖的机制。4.在PA细胞株和裸鼠荷瘤模型中,探讨Drp1影响垂体腺瘤细胞凋亡的机制。5.在PA细胞株和裸鼠荷瘤模型中,探讨自噬在Drp1调节PA细胞生长中的作用。四、研究方法1.Drp1在PA临床手术标本中的表达水平研究:利用手术收集的人类PA标本,按照增殖能力分组后,采用q RT-PCR和免疫组化（Immunohistochemical,IHC）的实验方法,从基因和蛋白水平分别检测Drp1在各组手术标本中的表达量,并通过统计学分析表达量差异。2.Drp1对垂体腺瘤细胞增殖及凋亡的影响研究:使用PA细胞株（GH3,MMQ,At T20）,进行体外细胞培养;利用慢病毒载体构建Drp1过表达稳转GH3细胞株,q RT-PCR和western blotting法检验转染效率;CCK-8法评估Drp1对PA细胞株增殖能力影响;流式细胞术检测Drp1对PA细胞凋亡率的影响;构建裸鼠荷瘤模型,在动物体内评估Drp1对PA皮下成瘤能力的影响。3.Drp1影响垂体腺瘤细胞线粒体结构及功能及细胞增殖的机制研究:透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）观察Drp1对GH3细胞线粒体结构的影响;JC-1染色GH3细胞后,在激光共聚焦显微镜下观察Drp1对GH3细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的改变;使用Agilent Seahorse XF96能量代谢检测仪分别检测Drp1对GH3细胞氧耗率（oxygen consumption rate,OCR）及胞外酸化率（extracellμlar acidification rate,ECAR）的影响;化学发光仪检测Drp1对GH3细胞总三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）产量的影响;流式细胞术检测Drp1对GH3细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的影响;选择线粒体ROS的特异性抑制剂Mito-TEMPO,分别处理空载体（Vector）组和Drp1-OE组细胞后,再次检测上述线粒体功能指标,同时观察Mito-TEMPO对GH3细胞增殖能力的影响。4.Drp1影响垂体腺瘤细胞凋亡的机制研究:免疫荧光（Immunofluorescence,IF）法染色GH3细胞的细胞色素c（Cytochrome c）蛋白,在激光共聚焦显微镜下观察Drp1对GH3细胞中细胞色素c分布的影响;Western boltting法检测Drp1对GH3细胞中线粒体凋亡通路的激活水平,分别使用Mdivi-1、Mito-TEMPO和细胞色素c释放抑制剂环孢素A（Cyclosporin A,Cs A）,在该通路的不同阶段施加干预,重复检测通路激活水平,利用sh RNA技术敲降GH3细胞的细胞色素c蛋白表达,经q RT-PCR和western blotting检验转染效率后,western boltting法检测下游凋亡分子的激活水平;通过流式细胞术检测上述不同干预方法对PA细胞凋亡率的影响;在裸鼠荷瘤模型标本中,检测Drp1对GH3细胞的线粒体释放细胞色素c释放量的影响。5.自噬在Drp1调节垂体腺瘤细胞生长中的效应研究:利用TEM观察Drp1对GH3细胞的自噬小体数量影响并加以统计分析;western boltting法检测Drp1对GH3细胞中AMPK-ULK1自噬通路的激活水平;利用Compound C（CC）分别处理Vector组和Drp1-OE组细胞后,再次对AMPK-ULK1自噬通路的激活水平进行评估;利用裸鼠荷瘤模型,在动物体内评估Drp1对GH3细胞自噬水平的影响。CCK-8法分别检测CC和自噬抑制剂甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）对GH3细胞增殖能力的影响;流式细胞术评估3-MA对GH3细胞凋亡率的影响;Western blotting检测3-MA对GH3细胞的线粒体释放细胞色素c水平的影响。五、研究结果1.Drp1表达量与PA增殖指数负相关。（1）人正常垂体RNA标准品中Drp1 m RNA表达量显著高于人类PA标本。（2）相较高增殖指数PA（high proliferation index PA,LI-PA）,Drp1 m RNA表达量在低增殖指数PA（low proliferation index PA,LI-PA）标本中显著上调。（3）相较HI-PA,Drp1蛋白表达量在LI-PA标本中显著上调。2.PA细胞增殖力受到Drp1过表达的显著抑制,凋亡率显著上调。（1）Drp1抑制剂Mdivi-1可显著促进PA细胞株的增殖能力。（2）过表达Drp1显著抑制了GH3细胞的增殖能力。（3）过表达Drp1显著促进GH3细胞的凋亡,Mdivi-1显著抑制其凋亡水平。（4）在裸鼠荷瘤模型中,过表达Drp1显著抑制了PA皮下成瘤能力,Mdivi-1可显著减弱Drp1的这一抑制效应。3.Drp1通过ROS过载损伤线粒体,进而引发PA细胞能量缺乏,抑制了细胞增殖。（1）过表达Drp1对GH3细胞的线粒体结构造成了损伤。（2）过表达Drp1引发GH3细胞的线粒体膜电位（MMP）下降。（3）过表达Drp1造成GH3细胞的氧耗率（OCR）显著下降。（4）过表达Drp1造成GH3细胞的ROS含量显著上升。（5）Mito-TEMPO靶向抑制GH3细胞的线粒体ROS,可以使MMP、OCR等体现线粒体功能的指标得到显著恢复。（6）过表达Drp1造成GH3细胞的总ATP产量显著下降。（7）Mito-TEMPO显著恢复因Drp1过表达后被抑制的GH3细胞总ATP产量及增殖能力。4.Drp1促进受损线粒体释放细胞色素c,激活下游促凋亡蛋白,诱导PA细胞凋亡。（1）过表达Drp1显著上调了GH3细胞的细胞色素c的释放量,进而激活下游级联凋亡反应,显著促进GH3细胞凋亡。（2）线粒体ROS靶向抑制剂Mito-TEMPO显著减弱Drp1对GH3细胞的促凋亡效应。（3）线粒体膜透性抑制剂Cs A显著减弱Drp1对GH3细胞的促凋亡效应。（4）Cycs sh RNAs使GH3细胞的细胞色素c表达量显著下调,显著减弱了Drp1对GH3细胞的促凋亡效应。（5）在裸鼠模型中,过表达Drp1显著促进细胞线粒体释放促凋亡分子细胞色素c。5.Drp1诱导的能量压力通过激活AMPK-ULK1信号通路增强PA细胞保护性自噬。（1）过表达Drp1使GH3细胞自噬小体数量显著增加。（2）过表达Drp1激活AMPK-ULK1信号通路显著促进GH3细胞的自噬,CC可以显著抑制Drp1对细胞自噬的激活效应。（3）CC可以显著强化Drp1对GH3细胞增殖能力的抑制效应。（4）自噬抑制剂3-MA可以显著增强Drp1对GH3细胞的生长抑制效应,显著增强Drp1诱导GH3细胞的线粒体释放细胞色素c。（5）在裸鼠荷瘤模型中,过表达Drp1显著促进瘤体细胞的自噬。六、结论1.PA手术标本中Drp1表达量与肿瘤增殖指数负相关。2.Drp1过表达抑制PA细胞增殖,诱导PA细胞凋亡。3.过表达Drp1可以诱导线粒体ROS过载损伤线粒体,导致PA细胞能量缺乏,进而抑制细胞增殖。4.Drp1过表达促进PA细胞受损线粒体释放细胞色素c,激活下游级联凋亡反应,促进细胞凋亡。5.Drp1过表达诱导的能量应激通过激活AMPK-ULK1通路增强了PA细胞的保护性自噬。