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舌鳞状细胞癌(Tongue squamous cell carcinoma, TSCC)患者早期易发生颈部淋巴结转移,明显影响其预后,并决定肿瘤分期及治疗方案。于是及时诊断及治疗舌癌患者颈部转移淋巴结成为提高生存率的迫切需求。基于临床上尚无一种可靠客观的无创性检查和治疗手段。第4代声学造影剂由于具备有靶向诊断和靶向给药的功能成为诊疗舌癌原发灶及其颈部淋巴道转移灶的探索方向。其中,高分子聚合物作为第4代超声造影剂(Ultrasound contrast agent, UC A)外壳材料之一,聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(Lactic-co-glycolic acid), PLGA]具备优异的生物相容性、可控生物降解性、良好的成球或成膜性能以及增加药物和DNA投递和定位的功效优势。TATp(transactivating transcriptional activator protein from human immunodeficiency virus type 1, HIV-1 TAT)人类免疫缺陷病毒的反式转录活化因子作为细胞穿膜肽之一,能将载药超声微泡(Ultrasound microbubble, UM)迅速、高效和安全的带入并滞留在细胞内部。但TATp缺乏细胞特异性。趋化因子SDF-1 (stromal cell-deried factor 1)又名为CXCL12,其唯一能与之结合并激活的受体为CXCR4,远高表达于出现转移淋巴结(Metastatic lymph node, MLN)的舌鳞癌细胞膜上,在不同口腔鳞癌细胞中阳性表达率高达72.3%～89.6%。而凋亡素蛋白(apoptin或VP3)由鸡贫血病毒(Chicken anemia virus, CAV)基因编码,具有肿瘤细胞特异性。对正常细胞无毒性,也同时具有一定靶向性。采用乳化溶剂挥发法(WI/O/W2)制备出靶向载药PLGA的UM,由于受到制备配方中多步骤的限制,仍然存在载药量(Drug loading,DL)较低问题,于是优化制备工艺成为必须。综上,本课题主要旨在制备一种TATp与SDF-1修饰的新型载VP3基因靶向高分子UM,并优化制备工艺,提高载药量。通过体外寻找舌scc-15细胞,验证所制得的UCA靶向性,从而为舌癌原发灶及其颈部淋巴道转移组织的无创早期诊断和非手术治疗提供一种新思路和新手段。本实验分以下两部分：第一部分靶向舌鳞癌细胞载基因超声微泡的制备及其优化目的：1.制备一种载VP3基因,并TATp与SDF-1同时修饰新型载基因高分子靶向UCA。并探讨制备因素对其粒径、载药量、包封率等.影响,从而筛选出制备UM的最佳组合。2.评价该靶向UCA基本特性、对DNA保护性、体外释放效果、分子成像效果以及TATp、SDF-1在高分子UM表面连接状况。方法：1.采用WI/O/W2法及真空冷冻干燥法制备载VP3基因PLGA的UM,并使用单因素和正交分析实验优化其制备条件,提高载药量。并通过硫醚键将SDF-1与TATp同时共价联接到微泡表面,制备出靶向舌鳞癌细胞载VP3基因PLGA的UM(TATp-SDF-1-VP3-PLGA-UM,TSVP-UM)。2.普通光学显微镜观察该UM形态以及分散性；Nano-Drop紫外分光光度计评估其载药量及包封率；透射电镜观察其内部结构；Malvern测量仪测定其粒径以及分布、表面电位；流式细胞仪(Flow cytometry, FC)及激光扫描共聚焦荧光显微镜(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)检测TATp、 SDF-1在高分子UM表面连接状况；酶切反应实验鉴定其对DNA保护性；Nano-Drop紫外分光光度计检测其体外释药性能；彩色多普勒超声成像诊断仪评价其体外成像效果。结果：1.使用单因素和正价分析所得最佳制备方案为VP3基因/PLGA质量比为1.6%,VP3基因浓度为8ug/ul,水相／油相体积比(W1/O)为1：15。2.靶向载基因UM呈规则球形,分散性好。粒径分布集中,大小以490.2-522.6nm之间为主,表面电位为-17-0mv。平均载药量为0.86%,平均包封率为40.47%。对DNA保护作用持续60min,未见损坏。长达24天缓慢持久释放VP3基因。单独TATp、SDF-1与PLGA微泡表面连接率分别为98.37%、97.07%。同时加载TATp、SDF-1于PLGA微泡表面的连接率,TATp为69,84%、SDF-1为71.08%。体外超声成像效果较好。结论：通过优化制备工艺及化学硫醚键联接成功制备出TSVP-UM。该UM粒径满足静脉给药需求,并具有载药量较高、长效缓释、体外成像效果较好的特性,兼具诊断和治疗的理想载药超声造影剂系统的基本性能。第二部分靶向舌鳞癌细胞载基因超声微泡制备及体外寻靶实验实验研究目的：按照优化方案制备TSVP-UM。并初步探讨其体外寻靶性能。方法：1.体外培养SCC-15细胞,接种6孔板,制备细胞爬片。2.按优化参数制备靶向组TSVP-UM,以及非靶向组载VP3基因高分子超声微泡(VP3-PEG-PLGA-UM, VPP-UM)。与细胞爬片共孵育30min～1h。3.光镜下比较观察两组UM与SCC-15细胞结合情况,流式细胞仪量化两者结合律。结果：1.光镜观察显示,靶向微泡组TSVP-UM簇聚化SCC-15细胞膜区域,少量已穿过细胞膜进入到胞质内部。而非靶向组VPP-UM较少粘附与细胞膜上。2.流式细胞仪半定量结果表明,靶向组联接率为91.44%,非靶向组为12.96%。结论：体外寻靶验证了TSVP-UM对SCC-15细胞具备较强靶向性。并且同时发现在较短时间内,TSVP-UM已少许穿膜进入到SCC-15细胞内部。初步验证了TSVP-UM壳层联接的TATp的生物活性。TSVP-UM作为一种非病毒基因载体有望成为一类作用于舌SCC及其淋巴道转移组织、安全有效的基因传递系统。