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研究目的:研究重楼活性单体PP-26对人胃癌细胞的增殖抑制作用,并探讨其作用机制,以期为重楼活性单体PP-26的开发利用提供实验依据。研究方法和研究内容:1.MTT法和细胞克隆形成抑制实验检测不同剂量PP-26对人胃癌MGC-803与BGC-823细胞的增殖抑制作用;2.Annexin V-FITC/PI双染色及流式细胞术检测胃癌细胞凋亡水平的变化,Hoechst33258染色检测PP-26对人胃癌细胞形态学的改变;3.JC-1染色法检测PP-26对人胃癌细胞线粒体膜电位的影响,蛋白免疫印迹法(westernblotting)检测PP-26对胃癌细胞Bcl-2家族蛋白以及凋亡相关蛋白表达水平的影响,用caspases抑制剂(Z-VAD-fmk)抑制凋亡相关蛋白表达检测PP-26对胃癌细胞凋亡相关蛋白的影响,探讨其增殖抑制作用与细胞线粒体凋亡途径是否存在联系;4.Western blotting检测PP-26对胃癌细胞Akt蛋白表达水平的影响,探讨其增殖抑制作用与Akt信号通路之间的联系。研究结果:1.MTT法检测发现,PP-26对人胃癌MGC-803与BGC-823细胞的细胞毒性相对高于正常肝L02细胞以及人胚肾HEK293细胞,MGC-803细胞48与72h IC50分别为:2.45±0.11、1.57±0.07μmol/L;BGC-823细胞72 h IC50分别为:2.41±0.08μmol/L;人正常肝L02细胞与人胚肾HEK-293细胞24 h、48 h与72 h均未检测出IC50值。细胞克隆形成抑制实验结果发现,1~1.25μmol/L PP-26作用人胃癌MGC-803与BGC-823细胞7d后,细胞集落数量明显减少,细胞的克隆增殖能力受到抑制。2.Annexin V-FITC/PI双染色及流式细胞术检测发现,不同浓度PP-26作用人胃癌MGC-803 24 h与BGC-823细胞48 h后,随着药物浓度增加,细胞的总凋亡水平随之增加。对两种肿瘤细胞采用Hoechst33258染色及荧光显微镜观察,发现PP-26作用人胃癌MGC-803 24 h与BGC-823细胞48 h后,细胞发生形态改变,细胞核出现固缩、裂解,部分形成凋亡小体,说明PP-26作用人胃癌MGC-803 24 h与BGC-823细胞48h后,引起肿瘤细胞发生凋亡。3.JC-1法检测显示,PP-26作用人胃癌MGC-803与BGC-823细胞后,荧光显微镜下观察呈高绿低红荧光,说明细胞线粒体膜电位下降。Western blotting检测显示,PP-26作用人胃癌MGC-803细胞24 h与BGC-823细胞48 h后,凋亡调控蛋白Bcl-x L、Mcl-1均表达下降,Bax表达增加;另外,MGC-803细胞中Bak表达增加,BGC-823细胞中Bcl-2表达下降。凋亡相关蛋白Caspase9、Caspase3与PARP表达下降,cleavedCaspase3与cleaved PARP出现表达增加,说明PP-26作用人胃癌MGC-803与BGC-823细胞后,线粒体凋亡途径被激活,诱导胃癌细胞凋亡。4.Western blotting检测显示,不同浓度及时间梯度PP-26作用人胃癌MGC-803与BGC-823细胞后,Phospho-Akt蛋白的表达水平均下降,其下游蛋白GSK-3β磷酸化水平受到抑制,说明PP-26通过抑制Akt信号通路介导线粒体途径以及细胞凋亡通路的活化。结论:1.重楼活性单体PP-26对人胃癌MGC-803及BGC-823细胞表现出增殖抑制作用,对人正常肝L02细胞与人胚肾HEK293细胞具有相对较弱的细胞毒性。2.重楼活性单体PP-26通过抑制Akt信号通路,激活线粒体凋亡途径,从而发挥对人胃癌MGC-803与BGC-823细胞的增殖抑制作用。