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第一部分高血压患者血浆可溶性corin检测与CORIN基因分析目的：Corin是在心肌细胞中发现的一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，其主要功能是将心房利钠肽前体（pro-atrial natriuretic peptide，pro-ANP）转化为有活性的心钠肽（ANP），从而调节心脏功能和血压。锚定在细胞膜上的corin可被ADAM10（a disintegrin andmetalloproteinase domain-containing protein10）及corin自我切割，生成180、160和100kDa的可溶性片段。故血浆及细胞培养上清中可检测到可溶性corin，且血浆中可溶性corin水平与心功能及肾功能相关。Corin在血压调节中发挥重要作用，Corin基因敲除小鼠会发生高血压及妊娠高血压。在人类也发现与高血压及妊娠高血压发生相关的CORIN基因突变。但迄今，高血压患者血浆中的corin水平国内外尚未见报道，也未见高血压人群中大样本分析CORIN基因变异的研究。本研究中，我们将检测高血压患者血浆中可溶性corin水平，并对高血压患者CORIN基因进行测序分析，发现CORIN基因突变和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），并进一步研究CORIN基因变异对其分子机构和功能的影响，从而了解corin在高血压病理过程中的作用及机制。方法：1.采集正常人和高血压患者的血液样本，以EDTA为抗凝剂，离心后获得血浆和血细胞，分别保存备用。2.利用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法检测480例正常人和594例高血压患者血浆可溶性corin水平，对所得的数据进行统计学分析。3.提取正常人和高血压患者血细胞中的基因组DNA，作为聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的模板，扩增CORIN基因的22个外显子，对所得PCR产物进行DNA测序。4.分析CORIN基因变异所导致的氨基酸改变在corin蛋白结构中的位置。结果：1.我们对中国高血压患者和正常人群血浆可溶性corin水平进行了测定和比较分析，发现高血压患者血浆可溶性corin水平显著低于正常人（0.6±0.3vs.0.9±0.4ng/mL，p＜0.0001）。2.对高血压患者和正常人群分别进行了男性和女性的分组比较。发现在正常人中，男性血浆可溶性corin水平显著高于女性（0.9±0.03vs.0.8±0.03ng/mL，p=0.005）；在高血压患者中，血浆可溶性corin水平同样是男性高于女性（0.7±0.01vs.0.6±0.02ng/mL，p=0.005）。由此可见血浆可溶性corin水平与性别相关。3.对高血压患者和正常人群中男性与女性按年龄段进行分组比较时，发现同一性别各年龄段之间的corin水平无显著差异。4.我们发现并定义了insA（c.102103insA）、C13Y（131A→G）、D95Y（376G→T）、L334W（1094G→T）和H525R（1667A→G）等CORIN基因SNPs，其中SNPinsA在高血压患者群体中出现的频率明显高于正常人群（5.7vs.0.9%）。5.此外，在高血压患者中筛查到CORIN基因突变，R349H（1138G→A）、R530S（1683T→G）、P866S（2689T→C）及T924M（2864C→T），这些突变在正常人群中没有检测到。结论：我们对中国高血压患者和正常人群的血浆可溶性corin水平进行了检测，发现高血压患者的血浆可溶性corin水平比正常人显著降低，这一结果提示corin功能受损可能与高血压的发病机制相关。比较男性与女性血浆可溶性corin水平，发现在正常人和高血压患者群体中，女性血浆可溶性corin水平都显著低于男性。我们的结果提示，corin水平的降低可能为高血压的诊断提供新的依据。在高血压患者群体中存在CORIN基因突变和SNPs，其中SNP insA在高血压患者群体中出现的频率远远高于正常人群，而基因突变R349H、T924M、R530S只存在于特定的高血压患者家系，提示这些CORIN基因突变和SNPs可能与高血压发病机制相关。第二部分Corin变异体insA对corin细胞膜定位和功能的影响目的：Corin作为一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，大量表达于心肌细胞膜上，从而发挥其活化pro-ANP的生物学功能。作为一种跨膜蛋白，corin生物学活性的发挥依赖于其蛋白质在细胞膜上的正确定位，而在早期的研究中发现，当corin蛋白的胞质尾部变短时，会显著地减少corin在细胞膜上的定位，进而抑制corin的功能。我们在高血压患者群体中发现了一系列CORIN基因SNPs和突变，其中SNP insA位于corin蛋白质分子胞质尾部，或许会影响corin蛋白在细胞膜上的定位，抑制其活化pro-ANP的功能，进而参与高血压发病过程。因此，本研究旨在研究insA对corin蛋白的表达、细胞膜定位及功能的影响。方法：1.以野生型（WT）corin质粒为模板，运用基因定点突变法，构建insA corin质粒。2.将野生型及突变体质粒转染人胚肾（human embryonic kidney，HEK）293细胞，用含有pro-ANP的上清孵育转染后的HEK293细胞，然后收集上清和细胞，用免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）和蛋白印迹法（Western blotting）方法检测corin活化pro-ANP的情况，以及corin的表达与活化情况，从细胞水平研究insA对corin的功能、表达和活化的影响。3.将野生型和突变体质粒转染HEK293细胞后，以生物素标记膜蛋白（biotin-labelling）和流式细胞术（flow cytometry）的方法检测corin蛋白在细胞膜上的表达情况，研究基因突变对corin蛋白在细胞膜上的定位的影响。4.野生型和突变体质粒转染HEK293细胞后，用免疫荧光染色（immunofluorescence staining）的方法在共聚焦显微镜下观察corin蛋白质的亚细胞定位情况，研究基因突变对corin蛋白质在细胞内的合成与转运的影响。结果：1. CORIN基因SNP insA存在于高血压患者（23/401，5.7%）和正常人群（2/217，0.9%），高血压患者中出现频率显著高于正常人群（p＜0.01）。2.转染HEK293细胞后，发现insA并不影响corin在细胞中的表达，但是在功能研究中发现，insA活化pro-ANP的能力显著降低，其活性只有WT的41.3±8.5%（n=4，p＜0.01）。3. Corin酶原活化的实验中，发现insA的40kDa活化带占全部蛋白表达量的4.0±1.0%，显著低于WT（12.7±1.8%）（n=5，p＜0.01）。结果表明，insA并不影响corin蛋白在细胞中的表达，但是会显著减少corin的活化。4.生物素标记膜蛋白的实验中，发现在生物素标记的HEK293细胞中，insA在细胞膜上的表达较WT、活化位点突变体R801A和蛋白酶活性位点突变体S985A明显降低。同时，流式细胞术也证实了这一结果，转染WT之后的HEK293细胞表面corin阳性率为32.7±4.9%，而insA的阳性率为7.9±2.1%（p＜0.01vs. WT）。结果表明，insA影响了corin蛋白在细胞膜上的锚定。5.免疫荧光实验中，发现锚定到细胞膜上的insA corin蛋白显著少于WT。亚细胞定位显示一部分insA corin滞留在高尔基体管网结构中，提示insA corin蛋白质合成过程中，蛋白从高尔基体运输出来的过程受阻，影响了corin蛋白在膜上的锚定和酶原活化，进而影响其功能。6. Western blotting检测脱落到培养上清中corin蛋白，发现WT产生180、160和100kDa三条可溶性片段，而insA的180的含量显著少于WT，100kDa条带几乎检测不到。insA和WT的160kDa片段含量无明显差异。7. ELISA检测发现25名含有insA corin等位基因的个体的血浆可溶性corin水平显著低于215名正常个体（0.6±0.1vs.0.9±0.02ng/mL，p＜0.001）。结论：我们在国内高血压患者中首次发现并定义了一种corin变异体并命名为insA，该变异体改变corin胞质尾部氨基酸序列，所编码的corin蛋白胞质尾部缩短了29个氨基酸，本研究证明，insA在细胞膜上的表达量和酶原活化都有显著降低，进而影响了insAcorin的功能。且高血压患者中insA出现的频率显著高于正常人，提示着insA可能参与到高血压疾病的发病过程中。同时，本研究还揭示corin胞质尾部氨基酸序列对于corin蛋白在细胞膜上的正常表达与活化起着至关重要的作用。