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目的:胆汁淤积（cholestasis）是由于胆汁分泌或排泄障碍引起的一种病理生理过程,表现为肝脏及体循环内的胆汁酸等胆汁成分过度堆积。长期胆汁淤积情况下将会进展为肝纤维化甚至肝硬化。近年来,胆汁淤积的发生被认为与胆汁酸转运体的异常表达密切相关。作为细胞基底侧膜上的胆汁酸转运体之一,多药耐药相关蛋白3（multidrug resistance-associated protein 3,Mrp3）的生理功能是将胆汁酸从细胞内转运入血,在胆汁酸稳态平衡的维持中发挥着重要作用。当胆汁淤积发生时,Mrp3的蛋白表达显著上调,通过增加胆汁酸的分泌,从而减少胆汁酸在肝脏中的蓄积,是肝脏解毒的重要途径。然而,Mrp3在正常生理状态下和胆汁淤积状态下对胆汁酸转运的影响及机制尚未研究清楚。因此,本课题采用Mrp3基因敲除小鼠（Mrp3 knockout mice,Mrp3-/-小鼠）作为动物模型,考察其在正常生理状态下和胆汁淤积状态下体内胆汁酸轮廓及含量的变化,并初步探讨Mrp3在胆汁酸转运中的作用及机制。方法:1、Mrp3在正常生理状态下对胆汁酸转运的调控作用1)收集12周龄和16周龄时的Mrp3-/-小鼠及其野生型（wildtype,WT）C57BL/6J小鼠的血液和粪便;20周龄时收集小鼠的血液、尿液和粪便并且解剖收集小鼠的肝脏、胆囊、十二指肠、空肠、回肠、结肠和肾脏样本。2)用4%多聚甲醛固定新鲜的肝组织48 h后制成石蜡切片,用苏木精-伊红（HE）染色进行肝组织病理学检查,考察在Mrp3缺失是否对肝脏造成损伤。3)采用超高效液相质谱联用法（UHPLC-MS/MS）同时定量小鼠生物样本中的24种胆汁酸含量。4)采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测正常生理状态下Mrp3-/-小鼠和WT小鼠肝脏中胆汁酸合成酶（胆固醇-7-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase,Cyp7a1））、胆汁酸摄取蛋白（钠离子-牛磺酸共转运多肽（Na+-dependent taurocholic cotransporting polypeptide,Ntcp）和有机阴离子转运多肽1a1（organic anion transporting polypeptides 1a1,Oatp1a1））、胆汁酸外排转运蛋白（Mrp3、多药耐药相关蛋白 2（multidrug resistance-associated protein 2,Mrp2）、多药耐药相关蛋白 4（multidrug resistance-associated protein 4,Mrp4）、P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、有机溶质转运蛋白 α/β（organic solute transporter-α/β,Ostα/β）、胆汁酸盐输出泵（bile salt export pump,Bsep）、有机阴离子转运多肽 2b1（organic anion transporting polypeptides 2b1,Oatp2b1））以及调节相关核受体（法尼酯X受体（farnesoid X receptor,Fxr）、孕甾烷X 受体（pregnane X receptor,Pxr）、组成型雄甾烷受体（constitutive androstane receptor,Car））和细胞核转录因子肿瘤抑制蛋白 p53（tumor suppressor protein p53,p53）的 mRNA 水平的表达。2、Mrp3在LCA诱导的胆汁淤积情况下对胆汁酸转运的调控作用1)取9-10周龄雄性和雌性Mrp3-/-小鼠和WT小鼠,采用LCA诱导胆汁淤积。胆汁淤积组（LCA组）的小鼠每组连续腹腔注射125mg/kg/d LCA 5天。对照组（CO组）腹腔注射相应体积的玉米油。2)收集LCA组和CO组小鼠的新鲜肝脏。用4%多聚甲醛固定48 h后进行HE染色分析,观察肝组织的变化情况。3)采用UHPLC-MS/MS定量LCA组和CO组小鼠各组织中的胆汁酸轮廓。4)RT-PCR法检测LCA组和CO组小鼠肝脏中胆汁酸合成酶、胆汁酸摄取蛋白、胆汁酸外排蛋白、相关核受体和细胞转录因子的mRNA表达。结果:1、Mrp3在正常生理状态下对胆汁酸转运的调控作用1)肝脏HE染色结果显示,Mrp3-/-小鼠与WT小鼠的肝脏病理学形态没有明显差别,Mrp3-/-小鼠肝脏有轻微炎症2)相比较于WT小鼠,Mrp3-/-小鼠肝脏总胆汁酸和回肠总胆汁酸含量显著增加（P<0.05）。其他部位的胆汁酸含量变化不显著（总胆汁酸含量变化不超过2倍）。3)正常生理状态下,相比较于雄性WT小鼠,雄性Mrp3-/-小鼠肝脏中的Bsep mRNA表达显著上升（P<0.05）;比较于雌性WT小鼠,雌性Mrp3-/-小鼠肝脏中的Mrp2 mRNA表达显著上升（P<0.05）。2、Mrp3在LCA诱导的胆汁淤积情况下对胆汁酸转运的调控作用1)HE染色结果表明WT和Mrp3-/-小鼠经LCA诱导后,肝脏大面积坏死,肝小叶轮廓不清,炎症细胞浸润和中性粒细胞浸润。WT胆汁淤积小鼠和Mrp3缺失的胆汁淤积小鼠肝脏病理学形态没有明显的变化。2)LCA诱导的胆汁淤积小鼠的血清总胆汁酸和肝脏总胆汁酸含量显著高于对照组小鼠（P<0.05）。雌性Mrp3-/--LCA组小鼠的血清游离型胆汁酸、胆囊游离型胆汁酸和总胆汁酸比雌性WT-LCA组小鼠的相应胆汁酸显著增高（P<0.05）。3)LCA诱导的胆汁淤积小鼠的Mrp2mRNA表达显著低于相应的对照组小鼠（P<0.05）,但是Ostβ的表达显著上升（P<0.05）。与对应的对照组小鼠相比,Mrp3-/-胆汁淤积组小鼠的Cyp7a1 mRNA表达显著降低（P<0.05）,但是WT胆汁淤积小鼠和WT对照组小鼠的Cyp7a1的mRNA表达没有明显差别。结论:正常生理状态下,Mrp3-/-小鼠无明显肝损伤,仅有轻微炎症,表明Mrp3-/-小鼠肝脏蓄积的胆汁酸含量并不足以导致肝损伤,可能是因为Mrp2和Bsep的表达上调起到替代作用。LCA诱导的胆汁淤积情况下,Mrp3--胆汁淤积小鼠和WT胆汁淤积小鼠的肝脏病理学形态没有明显差别,且肝肠循环中总胆汁酸也没有差别。但是与相应的对照组相比,Mrp3-/-胆汁淤积小鼠Cyp7a1 mRNA显著降低,而WT胆汁淤积小鼠的Cyp7a1 mRNA没有明显变化。