研究目的:内皮细胞释放大量的血管活性物质,参与内皮细胞和血管功能的调节,这些因子产生相似或相反的作用,在维持血管张力平衡、保持血管内表面的抗血栓活性、抗白细胞和血小板粘附聚集等方面发挥重要作用。内皮细胞功能紊乱时,内皮活性物质之间失去平衡,血管张力调节、凝血和纤溶系统功能紊乱,促进心血管疾病的发生和发展。因此,靶向内皮细胞,改善内皮功能紊乱,是心血管疾病新的治疗策略。内皮细胞ATP敏感钾离子通道(ATP-sensitive potassium channel, KATP channel)和非神经性毒蕈碱受体(non-neuronal muscarinic receptor,NNMR)是我们研究室首次提出的具有内皮保护作用新的药物靶标;激活KATP和NNMR能上调内皮细胞NO系统,改善内皮细胞功能;KATP开放剂埃他卡林、纳他卡林和NNMR激活剂槟榔碱具有内皮保护作用,但是它们保护内皮细胞的具体机制尚未完全阐明。基础和临床研究表明,ChemR23在鱼油和阿司匹林合用降低心血管事件发生率的过程中发挥关键作用,激活ChemR23介导的抗炎和消炎反应可能是重要机制。本研究旨在探讨,Chem/ChemR23轴与内皮细胞功能之间的关系,以及激活KATP和NNMR对ChemR23及其内源性配体chemerin为核心的Chem/ChemR23轴的调节作用。研究内容:为阐明Chem/ChemR23轴对内皮功能的影响,及其在激活KATP和NNMR改善内皮功能中的作用,本研究采用原代培养的大鼠胸主动脉内皮细胞(rat aortal endothelial cells,RAECs),利用心血管独立危险因素高同型半胱氨酸、高尿酸、高糖和高血脂造成内皮细胞功能紊乱模型,观察外源性chemerin、KATP开放剂埃他卡林和纳他卡林及NNMR激活剂槟榔碱对内皮细胞NO释放的影响,以及ChemR23抗体的阻断作用。在同型半胱氨酸、尿酸、葡萄糖和ox-LDL损伤内皮细胞形成内皮功能紊乱的细胞模型上,观察埃他卡林、纳他卡林和槟榔碱对功能紊乱内皮细胞chemerin分泌、ChemR23蛋白/基因表达的调控,以探讨埃他卡林、纳他卡林和槟榔碱对内皮细胞Chem/ChemR23轴的影响,以及三个药物的作用与KATP和NNMR激活的关系。利用ChemR23抗体,本研究还观察了ChemR23介导的信号转导分别在埃他卡林和槟榔碱单独或联合用药促进内皮细胞NO释放中的作用。研究方法和结果:1. Chem/ChemR23轴激活促进内皮细胞NO的释放采用硝酸酶还原法,我们检测了chemerin和ChemR23抗体对内皮细胞释放的NO能力的影响。尿酸7.5 mg/L刺激内皮细胞16 h后,内皮细胞生成的NO从27.6±6.2μmol/L减少到14.7±5.8μmol/L,显着降低了46.8%;chemerin 10 ng/L、100 ng/L和300 ng/L预孵育内皮细胞6 h后,内皮细胞NO生成分别增加到25.9±7.8μmol/L、27.1±6.7μmol/L和24.5±8.1μmol/L,与高尿酸损伤组相比,分别增加了76.6%, 84.7%和67.2%;ChemR23抗体1μg /ml和chemerin 100 ng/L组,NO生成为16.3±4.0μmol/L,与chemerin 100 ng/L组相比减少了39.9%。ECV304内皮细胞在1%FBS M199培养基孵育16 h后,细胞培养上清液NO生成的量为113.6±24.8μmol/L;给予Ab-ChemR23 0.04μg/ml、0.2μg/ml和1μg/ml预处理16 h后,NO生成分别为86. 7±27.7μmol/L、44.2±25.7μmol/L、-10.3±20.4μmol/L;0.2μg/ml和1μg/ml Ab-ChemR23预孵育显着减少正常内皮细胞NO的生成,并且随着浓度的继续增大(5μg/ml),内皮细胞NO生成完全消失。2.心血管危险因素对内皮细胞ChemR23基因表达的影响采用RT-PCR的方法,我们检测了心血管危险因素对内皮细胞ChemR23基因表达的影响。0.1 mM、0.5 mM和5 mM的同型半胱氨酸作用于内皮细胞6 h, ChemR23基因表达分别降低了17.5%, 33.7%和43.1%;0.1 mM同型半胱氨酸作用于内皮细胞3 h、6 h、12 h分别使ChemR23基因表达降低17.6%、18.7%和21.7%。7.5 mg/L和37.5 mg/L的尿酸作用于内皮细胞24 h后,ChemR23的基因表达分别下调31.4%和50.1%;7.5 mg/L的尿酸作用于内皮细胞4 h、8 h、16 h和24 h后ChemR23的基因表达分别下调34.9%、36.8%、36.8%和37.5%。10 mM、25 mM、50 mM D-葡萄糖作用于内皮细胞16 h,ChemR23的基因表达分别降低22.9%、29.7%和37.0%;25 mM D-葡萄糖作用于RAECs 4 h、8 h、16 h、24 h后,内皮细胞ChemR23的基因水平在16 h和24 h表达分别降低28.7%和28.0%。50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml的ox-LDL作用于内皮细胞12 h后, ChemR23的基因表达被100μg/ml和150μg/ml的ox-LDL分别显着降低47.9%和35.3%;100μg/ml的ox-LDL作用于内皮细胞6 h、12 h和24 h后ChemR23的基因表达分别显着降低37.8%、38.5%和43.5%。3.埃他卡林对Chem/ChemR23轴的调节采用Western blot和RT-PCR的方法,我们检测了埃他卡林对chemerin分泌、ChemR23蛋白和基因表达的调控作用。0.5 mM同型半胱氨酸作用于内皮细胞40 h,与空白对照组相比,内皮细胞chemerin分泌显着降低了24.5%;与同型半胱氨酸损伤组相比,埃他卡林10μM预孵育使chemerin分泌增加62.4%;格列本脲1μM可拮抗埃他卡林对chemerin分泌的影响。0.5 mM同型半胱氨酸作用于内皮细胞32 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23蛋白表达降低了12.8%;埃他卡林10μM使ChemR23的蛋白表达比模型组增加和27.7%;格列本脲1μM可拮抗埃他卡林对ChemR23蛋白表达的影响。0.1 m M同型半胱氨酸作用于内皮细胞6 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达降低了43.4%,埃他卡林1μM和10μM使ChemR23的基因表达分别比模型组增加85.7%和156.1%;格列本脲1μM拮抗埃他卡林对ChemR23基因表达的影响。7.5 mg/L尿酸作用于内皮细胞24 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达分别降低了35.3%,埃他卡林1μM和10μM使ChemR23的基因表达比高尿酸损伤组分别增加22.9%和27.6%;格列本脲1μM拮抗埃他卡林对高尿酸诱导ChemR23基因表达下调的作用25 mM D-葡萄糖作用于内皮细胞16 h,与空白对照组相比,内皮细胞ChemR23基因表达降低了40.0%;埃他卡林1μM、10μM使ChemR23的基因表达比高糖损伤组增加30.6%和45.9%;格列本脲1μM拮抗埃他卡林对高糖诱导ChemR23基因表达下调的作用。100μg/ml ox-LDL作用于内皮细胞12 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达降低了46.5%,埃他卡林0.1μM、1μM和10μM使ChemR23的基因表达分别比ox-LDL损伤组增加35.3%、197.6%和194.2%;格列本脲1μM拮抗埃他卡林对ox-LDL诱导ChemR23基因表达下调的作用。4.纳他卡林对Chem/ChemR23轴的调节采用Western blot和RT-PCR的方法,我们检测了纳他卡林对ChemR23蛋白和基因表达的调控作用。0.5 mM同型半胱氨酸作用于内皮细胞32 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23蛋白表达降低了49.6%;1μM和10μM纳他卡林预孵育8 h,使ChemR23的蛋白表达比模型组分别增加了93.2 %和103.6%;格列本脲1μM拮抗纳他卡林对ChemR23蛋白表达的影响。0.1 mM同型半胱氨酸作用于内皮细胞6h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达降低了41.6%;纳他卡林0.1μM、1μM和10μM使ChemR23的基因表达比模型组分别增加了2.04倍、2.31倍和2.44倍。格列本脲1μM拮抗纳他卡林对ChemR23基因表达的影响。7.5 mg/L尿酸作用于内皮细胞24 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达降低了28.8%,纳他卡林0.1μM、1μM、10μM使ChemR23的基因表达比高尿酸损伤组增加54.3%、97.3%、114.6%;格列本脲1μM拮抗纳他卡林对高尿酸诱导ChemR23基因表达下调的作用。25 mM D-葡萄糖作用于内皮细胞16 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达降低了40.0%,纳他卡林0.1μM、1μM和10μM使ChemR23的基因表达比D-葡萄糖损伤组分别增加27.6%、48.9%和69.2%;格列本脲1μM拮抗纳他卡林对高糖诱导ChemR23基因表达下调的作用100μg/ml ox-LDL作用于内皮细胞12 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达分别降低了46.5%,纳他卡林0.1μM、1μM和10μM使ChemR23的基因表达比ox-LDL损伤组分别增加173.5%、374.1%和322.0%;格列本脲1μM可拮抗纳他卡林上调ox-LDL抑制ChemR23基因表达的作用。5.槟榔碱对内皮细胞Chem/ChemR23轴的调节采用Western blot和RT-PCR的方法,我们检测了槟榔碱对chemerin分泌、ChemR23蛋白和基因表达的调控作用。0.5 mM同型半胱氨酸作用于内皮细胞40 h后,与空白对照组相比内皮细胞chemerin的分泌减少19.7%,与模型组相比槟榔碱10μM显着增加chemerin分泌36.6%。0.5 mM同型半胱氨酸刺激内皮细胞32 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23蛋白表达降低了41.6%;10μM槟榔碱使ChemR23的蛋白表达比模型组增加87.0%;M受体拮抗剂阿托品1μM拮抗槟榔碱对ChemR23蛋白表达的影响。0.1 mM同型半胱氨酸作用于内皮细胞6 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达降低了50.7%,槟榔碱1μM使ChemR23的基因表达比模型组增加69.6%,10μM槟榔碱使ChemR23的基因表达比模型组增加71.0%;阿托品1μM拮抗槟榔碱对ChemR23基因和蛋白表达的影响。7.5 mg/L尿酸作用于内皮细胞24 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达降低了29.9%;槟榔碱1μM和10μM使ChemR23的基因表达比高尿酸损伤组分别增加49.1%和52.1%;阿托品1μM拮抗槟榔碱对高尿酸抑制ChemR23基因表达的影响。25 mM D-葡萄糖作用于内皮细胞16 h,与空白对照组相比内皮细胞ChemR23基因表达降低了40.1%;槟榔碱1μM、10μM使ChemR23的基因表达分别比D-葡萄糖损伤组增加47.7%和80.0%;阿托品1μM拮抗槟榔碱对高糖诱导ChemR23基因表达下调的作用。100μg/ml ox-LDL作用于内皮细胞12 h,与空白对照组相比,内皮细胞ChemR23基因表达降低了33.3%;槟榔碱1μM和10μM使ChemR23的基因表达分别比ox-LDL损伤组增加76.8%和92.8%;阿托品1μM能拮抗槟榔碱上调被ox-LDL抑制的ChemR23基因表达。6. Chem/ChemR23轴在激活KATP和NNMR促进内皮细胞NO释放中的作用采用硝酸酶还原法,我们检测了KATP开放剂埃他卡林、纳他卡林和NNMR激活活剂槟榔碱对内皮细胞产生NO能力的影响。7.5 mg/L的尿酸孵育内皮细胞16 h后,内皮细胞生成的NO从21.7±6.6μmol/L减少为13.4±6.5μmol/L,减少了38.5%;埃他卡林10μM预孵育内皮细胞6 h后,内皮细胞NO生成升高为32.5±7.7μmol/L,与高尿酸损伤组相比,NO生成增加了142.9%;埃他卡林10μM和ChemR23抗体预孵育后,内皮细胞NO生成降为8.9±6.8μmol/L,与埃他卡林10μM处理组相比,NO生成降低了72.6%,埃他卡林10μM促进内皮细胞NO释放的作用被取消。尿酸7.5 mg/L作用于内皮细胞16 h后,与空白对照组相比,模型组NO生成从35.0±5.5μmol/L减少到28.4±4.5μmol/L,显着减少了19.0%(P<0.05,n=7);纳他卡林0.1μM、1μM和10μM预孵育内皮细胞6 h,NO生成分别为38.6±8.8μmol/L、38.8±5.7μmol/L和47.9±8.4μmol/L,与尿酸损伤组相比,NO生成分别增加36.0%、36.7%和56.6%;格列本脲1μM显着拮抗拮抗纳他卡林10μM的作用,拮抗后生成的NO为33.3±9.5μmol/L,与纳他卡林10μM组相比,格列本脲拮抗组的NO生成减少了25.0%。尿酸7.5 mg/L刺激内皮细胞16 h后,与空白对照组相比,模型组NO生成从24.8±4.4μmol/L减少到15.9±6.0μmol/L,显着降低了35.7% (P<0.01,n=7);槟榔碱0.1μM、1μM和10μM预孵育内皮细胞6 h,NO生成分别增加到24.7±7.3μmol/L、38.2±15.3μmol/L和33.6±12.9μmol/L,与尿酸损伤组相比,NO生成分别增加了55.2%、139.7%和111.2% (P<0.05或P<0.01,n=7);1μg/ml Ab-ChemR23预孵育内皮细胞1 h,NO生成减少到16.6±10.3μmol/L,与槟榔碱10μM处理组相比,NO生成降低了50.7% (P<0.05,n=7),槟榔碱10μM促进内皮细胞NO释放的作用消失。尿酸7.5 mg/L刺激内皮细胞16 h后,NO生成从17.5±3.4μmol/L下降到9.8±3.0μmol/L,与空白对照组相比,模型组NO生成减少44.1%;埃他卡林10μM单独预孵育内皮细胞6 h后NO的生成为20.2±5.5μmol/L,与尿酸损伤组相比,促使NO生成增加了106.5%;槟榔碱1μM单独预孵育NO生成为23.9±5.5μmol/L,促使NO生成比高尿酸损伤组增加了144.0%;埃他卡林10μM和槟榔碱1μM联合预孵育内皮细胞,NO生成为23.7±9.5μmol/L,与高尿酸损伤组比使NO生成增加了142.2%;1μg/ml ChemR23抗体预孵育能拮抗埃他卡林10μM和槟榔碱1μM的作用,NO生成降为11.7±5.6μmol/L,与埃他卡林10μM和槟榔碱1μM联合处理组相比,NO生成降低了50.5%,埃他卡林和槟榔碱促进内皮细胞NO释放的作用被ChemR23抗体取消。研究结论:由此可见,加入外源性chemerin,内皮细胞Chem/ChemR23轴信号增强能促进NO释放,阻断ChemR23信号转导,则抑制内皮细胞NO释放,内皮细胞Chem/ChemR23信号转导可能与内皮细胞NO生成途径相关;高同型半胱氨酸、高尿酸、高糖和ox-LDL在引起内皮细胞功能紊乱时,也显着降低chemerin的分泌、ChemR23的蛋白和基因表达,抑制Chem/ChemR23轴的表达;KATP通道开放,尤其是SUR2B/Kir6.1亚型选择性开放,和NNMR激活上调内皮功能紊乱时被抑制的内皮细胞chemerin分泌和ChemR23蛋白/基因表达,以及ChemR23依赖的内皮细胞NO释放。因此内皮细胞KATP开放和NNMR激活,可以增强内皮细胞Chem/ChemR23轴的表达和活性,促进NO释放,改善NO相关的内皮功能。综上所述,Chem/ChemR23轴的表达和活性随着内皮功能紊乱而减弱, Chem/ChemR23轴的表达和活性增加能增强NO相关的内皮功能,Chem/ChemR23轴可能是内皮细胞一条新的内源性抗炎途径,保护内皮细胞和心血管系统功能;Chem/ChemR23轴可能发展为新的药理学靶标,激活KATP和NNMR能增强Chem/ChemR23轴的表达和活性,这可能是激活KATP和NNMR保护内皮细胞和心血管功能的重要机制。