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第一部分 炎症性肠病患者维生素D水平与肠道菌群的相关性分析目的:探究炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)患者血清总25羟维生素D(Total 25-hydroxyvitamin D,T-25(OH)D)水平与粪便菌群构成的关系。方法:收集23例IBD患者临床资料并采集新鲜粪便行16S rDNAV4区域扩增子测序分析,根据血清T-25(OH)D水平分为维生素D正常组(n=5例)、维生素D不足组(n=5例)和维生素D缺乏组(n=13例)三组。比较三组患者粪便菌群多样性和菌群构成差异;应用Spearman相关性分析方法分析血清T-25(OH)D水平与门、科和属水平粪便细菌丰度之间的相关性。结果:1.三组IBD患者的粪便菌群α多样性、β多样性无显著差异。2.Actinpbacteria(放线菌门)相对丰度在维生素D正常组最高,而Proteobacteria(变形菌门)相对丰度在维生素D缺乏组最高。3.门水平:血清T-25(OH)D水平与Actinpbacteria(放线菌门)相对丰度正相关(r=0.447,P=0.033),而与Proteobacteria(变形菌门)相对丰度负相关(r=-0.445,P=0.033);科水平:血清T-25(OH)D水平与 Lachnospiraceae(毛螺菌科)(r=0.414,P=0.049)、Bifidobacteriaceae(双歧杆菌科)(r=0.468,P=0.024)、Erysipelotrichaceae(r=0.584,P=0.003)和Eggerthellaceae(埃格特菌科)(r=0.507,P=0.014)的相对丰度正相关,与Aerococcaceae(气球菌科)(r=-0.514,P=0.012)的相对丰度负相关;属水平:血清T-25(OH)D水平与Blautia(布劳特斯菌属)(r=0.459,P=0.028)、Bifidobacterium(双歧杆菌属)(r=0.468,P=0.024)、Faecalitalea(r=0.544,P=0.007)、Anaerostipes(r=0.475,P=0.022)、Romboutsia(r=0.510,P=0.013)、Flavonifractor(r=0.455,P=0.029)和Erysipelatoclostridium(r=0.617,P=0.002)的相对丰度正相关。结论:不同血清T-25(OH)D水平的IBD患者粪便菌群构成存在差异,血清T-25(OH)D水平与Proteobacteria(变形菌门)等有害菌的相对丰度负相关,而与Lachnospiraceae(毛螺菌科)和Bifidobacteriaceae(双歧杆菌科)等益生菌的相对丰度正相关。第二部分维生素D3联合鼠李糖乳杆菌对小鼠葡聚糖硫酸钠急性结肠炎的保护作用及其机制研究背景:IBD患者T-25(OH)D水平下降,且T-25(OH)D水平与疾病活动度负相关,但补充维生素D(Vitamin D,VitD)抗炎疗效欠佳,与结肠上皮细胞维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)表达减低有关,鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)可上调肠上皮VDR表达。目的:本研究拟评估VitD3联合LGG对小鼠结肠炎的协同保护作用及相关机制。方法:1.Vdr+/+小鼠:25只Vdr+/+ C57BL/6雄性小鼠随机分为5组(n=5):非模型对照组、DSS模型组、VitD3干预组、LGG干预组、VitD3联合LGG干预组。饮用含有2.5%DSS的饮用水5天建模。DSS建模前7天至开始建模后6天,各干预组分别予 VitD3 100IU/d、LGG 1.95×10^8CFU/d、VitD3 100IU/d 联合 LGG 1.95×10^8CFU/d 灌胃。通过体重变化、疾病活动指数(Disease activity index,DAI)、结肠长度和结肠病理损伤评分评估结肠炎严重程度。收集血标本检测血清T-25(OH)D水平。收集结肠标本采用qRT-PCR检测细胞因子转录水平,采用qRT-PCR、Western blot和免疫组化检测VDR表达量及分布,采用免疫组化评估结肠上皮细胞Ki67表达量。2.Vdr-/-小鼠:12只Vdr-/-C57BL/6雄性小鼠分为3组:非模型对照组(n=3)、DSS模型组(n=4)和VitD3联合LGG干预组(n=5)。以上三组建模、干预及检测同Vdr+/+非模型对照组、DSS模型组和VitD3联合LGG干预组。结果:1.在Vdr+/+小鼠实验中,与非模型对照组比较,DSS模型组小鼠结肠黏膜VDR总蛋白及核蛋白表达量下降(P<0.05)。各干预组分别与DSS模型组比较,VitD3干预组小鼠第6天DAI、结肠缩短程度、结肠病理损伤评分有减低趋势,但未达统计学差异(P>0.05);LGG干预组小鼠第6天体重下降程度和DAI减低(P<0.05),结肠上皮细胞Ki67染色阳性细胞百分比增高(P=0.038);VitD3联合LGG干预组小鼠第6天DAI、结肠短缩程度和结肠病理损伤评分均减低(P<0.05),结肠黏膜TNFα mRNA相对表达量减低(P=0.028),IL-10 mRNA相对表达量增高(P=0.016),血清T-25(OH)D水平以及结肠黏膜VDR mRNA、VDR总蛋白和结肠上皮细胞核VDR表达量均增高(P<0.05),结肠上皮细胞Ki67染色阳性细胞百分比增高(P=0.002)。2.在Vdr-/-、鼠实验中,与DSS模型组Vdr-/-小鼠比较,VitD3联合LGG干预组Vdr-/-小鼠第6天体重下降程度、DAI、结肠短缩程度、结肠病理损伤评分、结肠黏膜TNFα mRNA相对表达量和结肠上皮细胞Ki67染色阳性细胞百分比均无明显变化(P>0.05)。结论:VitD3联合LGG通过上调结肠黏膜VDR表达,促进结肠上皮细胞增殖,调节结肠黏膜细胞因子表达,明显减轻小鼠DSS结肠炎。第三部分 维生素D3联合鼠李糖乳杆菌分泌蛋白p40对小鼠葡聚糖硫酸钠急性结肠炎的保护作用及其机制研究背景:VitD3联合LGG可通过促进结肠黏膜VDR表达发挥协同抗炎作用,但LGG协同VitD3发挥促进VDR表达的机制不明。p40为LGG分泌的具有抗炎作用的可溶性蛋白。目的:本研究拟评估p40对结肠上皮细胞VDR表达的作用以及VitD3联合p40对小鼠结肠炎的保护作用及机制。方法:1.体外实验:不同浓度p40(0～200ng/mL)刺激HCT116 48h和不同时长(0～48h)p40 100ng/mL刺激 HCT116 后,qRT-PCR 和 Western blot 检测 VDR 相对表达量;p40 100ng/mL 刺激 HCT116 48h,Western blot 检测细胞核 VDR、浆 VDR蛋白水平相对表达量;不同浓度p40(0～100ng/mL)刺激HCT116后MTT法测定细胞生长曲线。2.Vdr+/+小鼠体内实验:25只Vdr+/+C57BL/6雄性小鼠分为5组(n=5):非模型对照组、DSS模型组、VitD3干预组、p40干预组、VitD3联合p40干预组。饮用含有2.5%DSS的饮用水6天建模。DSS建模开始至撤除DSS后1天,各干预组分别予VitD3 100IU/d灌胃、p40 20μg/d灌肠、VitD3 100IU/d灌胃联合p4020μg/d灌肠。通过体重变化、DAI、结肠长度和结肠病理损伤评分评估结肠炎;检测血清T-25(OH)D水平;qRT-PCR、Western blot和免疫组化评估VDR表达量及分布;免疫组化评估结肠上皮Ki67表达量。结果:1.体外实验:与空白对照组比较,p40 50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL刺激48h后,p40100ng/mL刺激36h和48h后,HCT116 VDR蛋白相对表达量均增高(P<0.05);p40 100ng/mL刺激48h后HCT116核VDR相对表达量呈增高趋势,而胞浆VDR相对表达量无明显变化;p40 20ng/mL刺激24h后、p40 1～50ng/mL刺激48h后、p40 1～100ng/mL刺激72h后HCT116活细胞数量增多(P<0.05)。2.Vdr+/+小鼠体内实验:各干预组与DSS模型组比较,VitD3干预组小鼠第8天体重下降程度减低(P=0.036),血清T-25(OH)D水平增高(P<0.001);p40干预组小鼠第8天体重下降程度、结肠缩短程度和结肠病理损伤评分均呈减低趋势,但未达统计学差异(P>0.05),结肠黏膜VDR总蛋白和结肠上皮细胞核VDR蛋白表达量增高(P<0.05);VitD3联合p40干预组小鼠第8天体重下降程度、DAI、结肠短缩程度均减低(P<0.05),血清T-25(OH)D水平以及结肠黏膜VDR mRNA、VDR总蛋白和结肠上皮细胞核VDR蛋白表达量均增高(P<0.05),结肠上皮细胞Ki67染色阳性细胞百分比增高(P=0.032)。结论:VitD3联合p40可通过上调结肠黏膜VDR表达和促进结肠上皮细胞增殖减轻小鼠DSS结肠炎。