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研究背景糖尿病是当前严重的全球公共卫生问题,其中90%左右是2型糖尿病,在全球范围内的患病率逐年上升。糖尿病作为最常见的代谢性疾病之一,可以广泛损害多种器官和组织,包括心脏、肾脏、视网膜和中枢神经系统等,并导致严重的并发症,其中认知功能障碍是2型糖尿病中比较常见但却被严重低估的并发症。糖尿病患者的认知功能障碍表现在多个方面,包括学习和记忆能力、执行能力、注意力和情绪等。但目前对糖尿病相关认知功能障碍的临床表现和发病机制认识不足,对该并发症的临床治疗效果较差。因此,破译糖尿病相关认知功能障碍的机制,寻找新的策略来延迟或减少认知功能障碍的发生至关重要。神经炎症与认知功能障碍密切相关。小胶质细胞是大脑中的固有免疫细胞,是神经炎症的重要调节因子。活化的小胶质细胞可以分泌多种促炎介质,包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和活性氧,对神经元有毒性作用,而损伤的神经元反过来进一步活化小胶质细胞,从而加重神经炎症。小胶质细胞过度活化引起的神经炎症是认知功能障碍的主要特征,与神经退行性病变有相似的特征。因此,调控小胶质细胞的激活,以维持正常的生理稳态,是改善认知功能障碍的关键步骤。越来越多的研究表明,自噬通过调节小胶质细胞的活化来调节炎症和凋亡,从而改善认知功能。在活化的BV-2小胶质细胞系中,激活自噬可以抑制白细胞介素6的表达和脂多糖诱导的小胶质细胞死亡。褪黑素是松果体的主要分泌产物,可以调节昼夜节律、能量消耗、葡萄糖代谢、炎症因子分泌和凋亡等。然而,2型糖尿病患者血清中的褪黑素水平降低,昼夜节律紊乱。有研究发现,使用小剂量的褪黑素可以改善认知功能,且外源性褪黑素可以穿透血脑屏障,在不同的大脑区域发挥作用。在包括阿尔茨海默症在内的多种认知功能减退的实验模型中,都证明褪黑素能够抑制小胶质细胞的活化并降低促炎细胞因子水平。值得注意的是,褪黑素可以显著抑制toll样受体4的表达。鉴于褪黑素对认知功能障碍的重要性,本文将探讨褪黑素对于2型糖尿病认知功能障碍的作用及其潜在机制。研究目的探究褪黑素对T2DM认知功能障碍的作用及机制研究。研究方法1.体内实验:高脂饮食联合链脲佐菌素诱导T2DM小鼠模型,随机分为4组:对照组、褪黑素组、T2DM组、T2DM+褪黑素组。褪黑素（10mg/kg）腹腔注射,连续干预1个月后行Morris水迷宫实验检测四组小鼠的认知功能。行腹腔葡萄糖耐量实验（IPGTT）和腹腔胰岛素耐量实验（IPITT）,检测小鼠胰岛功能变化。处死小鼠,分离左侧大脑半球制作石蜡切片,进行HE、Nissl染色检测神经元凋亡,TUNEL染色检测小胶质细胞凋亡,免疫荧光染色检测海马Iba1、GFAP、TLR4、MAP1LC3B表达。分离右侧大脑半球海马,Western blot和RT-qPCR检测海马凋亡、炎症、自噬和TLR4/Akt/mTOR信号通路水平变化。2.体外实验:使用小鼠小胶质细胞系BV-2细胞,给予棕榈酸（PA,0.4mmol/L）和褪黑素（100nmol/L）进行干预。分为4组:对照组、褪黑素组、PA组、PA+褪黑素组。PA和褪黑素干预24h后,进行RT-qPCR和Western blot检测炎症、凋亡、自噬和TLR4/Akt/mTOR信号通路水平变化。给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA,5mmol/L）、TLR4 抑制剂 TAK-242（10umol/L）、Akt 抑制剂 MK-2206（10umol/L）分别检测自噬和TLR4/Akt/mTOR通路在褪黑素改善小胶质细胞凋亡和炎症中的作用。研究结果1.IPGTT和IPITT显示褪黑素可以改善T2DM小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。2.褪黑素可以改善T2DM小鼠的认知功能障碍,在隐藏平台实验中表现为潜伏期缩短,游泳路程减少,在探针实验中表现为在靶象限的时间和路程增加。3.褪黑素通过抑制小胶质细胞活化抑制神经炎症和神经元损害。T2DM小鼠海马CA1区神经元排列紊乱,细胞间隙变宽,核固缩,Nissl染色显示神经元内Nissl体数量减少,提示神经元功能障碍。TUNEL染色显示小胶质细胞凋亡增加,凋亡指标表达升高。褪黑素处理后神经元和小胶质细胞凋亡减少。T2DM小鼠海马星形胶质细胞和小胶质细胞活化增加,炎性细胞因子表达增加,NF-κB信号通路活化。褪黑素处理后小胶质细胞活化减弱,炎性因子表达降低,NF-κB通路表达减弱。4.褪黑素改善了 T2DM小鼠海马自噬缺陷,自噬体形成标记物表达增加,自噬降解标记物表达降低。5.体外实验显示褪黑素可以改善PA诱导的BV-2细胞凋亡和炎症,而自噬抑制剂3-MA逆转了褪黑素的抗炎和抗凋亡作用。6.T2DM小鼠海马和PA诱导的BV-2细胞中TLR4/Akt/mTOR信号通路活化,褪黑素处理后抑制了通路中TLR4、p-Akt、p-mTOR的表达。7.TLR4抑制剂TAK-242和Akt抑制剂MK-2206改善了 PA诱导的自噬缺陷,从而改善了炎症和凋亡。研究结论褪黑素通过抑制TLR4/Akt/mTOR信号通路激活自噬,从而抑制神经炎症和小胶质细胞凋亡,改善2型糖尿病小鼠的认知功能障碍。