论文部分内容阅读
颗粒蛋白前体PGRN（Progranulin,PGRN）是一个由593个氨基酸残基组成的分泌性糖蛋白分子。该分子由分泌信号肽（N端17个氨基酸）和7.5个衔接重复的结构域组成;不同结构域之间由连接区域隔开。这些重复的结构域分别命名为paragranulin、granulinG、F、B、A、C、D及E。成熟的PGRN经蛋白酶水解后可产生一组分子量约6 kDa的granulin（Gm）多肽,目前从人体中分离得到的Gm产物有GrnA、GrnB、GrnC、GrnD和GmF。PGRN及Gm产物均具有生物学功能,目前大多研究均集中于对PGRN生物学功能的研究。PGRN作为组织中分布广泛、功能多样的一个生长因子家族成员,参与了许多生理过程,如胚胎发育、组织修复以及炎症反应等。此外,PGRN与肿瘤细胞的增殖、浸润及肿瘤血管生成等过程密切相关。近年来研究发现,由于PGRN基因突变所引起的单倍剂量不足（haploinsufficiency）是导致具有泛素阳性包涵体特征的额颞叶变性（Frontotemporal Lobar Degeneration with ubiquitin-positive inclusions,FTLD-U）发生的主要因素之一,因此受到了科学家的高度重视。目前体内、外实验研究结果表明,PGRN和GrmE对神经细胞具有神经营养因子的功能,但对于PGRN突变引起FTLD-U的发病机制并不十分清楚。本课题旨在通过基因突变等分子生物学手段,体外研究PGRN基因突变对PGRN生物学功能的影响；通过酵母双杂交技术,筛选与PGRN相互作用的蛋白分子。从而为深入探讨PGRN生物学功能及其在神经退行性疾病FTLD-U中的分子作用机制奠定基础。该论文首先利用腺病毒真核表达系统,表达和纯化了 PGRN-6His融合蛋白,然后以此为免疫抗原进行了 PGRN单克隆抗体的制备,以期获得能够识别不同Gm多肽的单克隆抗体,为研究PGRN和Grm多肽的生物学功能及其在中枢神经系统中的作用提供有利的工具;其次,构建了一系列PGRN错义突变和N-糖基化位点突变的突变体,进而分析了上述突变体对于PGRN表达和功能的影响;最后,利用酵母双杂交技术,以PGRN作为诱饵蛋白,从人外周血白细胞cDNA文库中筛选与PGRN相互作用的蛋白,并对所筛选的分子进行了进一步的验证和分析。本课题具体研究内容如下:（1）PGRN-6His和PGRN-Flag蛋白的真核表达与纯化:首先通过分子生物学手段,进行PGRN基因的克隆,酶切鉴定及序列测定完全正确后,将PGRN基因分别连入腺病毒穿梭载体pAd5-E1-CMV-6His和pAd5-E1-CMV-Flag,然后通过在真核细胞内的同源重组制备重组腺病毒Ad5-PGRN-6His和Ad5-PGRN-Flag。将上述腺病毒分别感染Hela细胞,72h后收获上清,收获的上清经硫酸铵沉淀浓缩后通过Ni-NTA亲和柱或Flag抗体亲和柱纯化获得真核表达蛋白 PGRN-6His 和 PGRN-Flag。（2）PGRN单克隆抗体的制备与鉴定:用纯化的人PGRN-6His融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合;以纯化的人PGRN-Flag作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆杂交瘤细胞,阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆,将阳性克隆扩大培养后制备针对PGRN的单克隆抗体。经免疫印迹及细胞免疫荧光染色鉴定后,最终获得了 7株能特异性识别人PGRN的单克隆抗体,分别命名为2A5,4F10,5B7,6C1,6E2,3E7,8H9。其中,5B7,6C1,3E7可特异识别GrnB结构域,4F10可特异识别GrnA结构域,2A5,6E2,8H9可特异识别GrnC结构域。（3）PGRN单点突变体的构建及其功能研究:通过PCR定点突变获得PGRN 5个N-糖基化位点单点突变体（N118Q,N236Q,N265Q,N368Q,N530Q）、4个PGRN成熟蛋白错义单点突变体（C139R,P248L,S258N,R432）及1个信号肽突变体（A9D）。将上述突变体分别定向克隆至真核表达载体pAd5-E1-CMV-MCS-TAA及pAd5-E1-CMV-MCS-Flag中,并转染HEK 293细胞,然后通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA水平和蛋白水平上分析上述定点突变对于PGRN表达或分泌的影响,并检测了这些突变体对SH-SY5Y细胞增殖的影响。结果表明,各突变体在mRNA表达水平上无明显差异;在PGRN蛋白表达水平上,除信号肽突变体降低其表达和分泌外,其它突变体蛋白表达和分泌水平均无明显变化;所构建的突变体对SH-SY5Y细胞的增殖无显著影响。（4）利用酵母双杂交技术筛选与人PGRN相互作用的蛋白分子:构建了用于酵母双杂交筛选的诱饵载体pGBKT7-PGRN,然后通过检测BD-PGRN融合蛋白在酵母中的表达及证实融合蛋白的表达对酵母细胞的生长无毒性作用且无自激活作用后,以PGRN作为诱饵蛋白从人外周血白细胞cDNA文库中筛选与人PGRN相互作用的蛋白。通过测序及初步鉴定,获得了一个新的与PGRN具有相互作用的功能未知的细胞核内蛋白分子FAM76B。（5）PGRN与FAM76B相互作用的验证:利用PCR方法从人cDNA文库中克隆出FAM76B的全长基因,并构建了酵母表达猎物载体pGADT7-FAM76B。将诱饵载体pGBKT7-PGRN和猎物载体pGADT7-FAM76B共转化酵母,以进一步证实二者在酵母细胞中的相互作用;通过免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down实验验证了 PGRN与FAM76B的体内、体外相互作用;通过基因缺失及利用酵母双杂交技术进一步研究分析PGRN与FAM76B两个分子之间相互作用的结构域;通过共聚焦显微镜研究FAM76B与PGRN及Gm（s）在CHO细胞中的共定位情况。研究结果表明,PGRN与FAM76B之间存在着直接相互作用;在PGRN分子中,与FAM76B相互作用的结构域主要为GrmB和GrnC,而在FAM76B分子中,与PGRN发生相互作用的结构域为富含His区域;PGRN的片段GrmBACD在FAM76B存在的情况下,可以明显转位于细胞核内,并与核内的FAM76B共定位。综上所述,本课题研究获得了以下结果:（1）成功制备了可特异性针对人PGRN GrmB、GrmA及GmC结构域的单克隆抗体;（2）成功构建了一系列的PGRN突变体,并研究了它们对PGRN表达水平的影响及对SH-SY5Y细胞增殖的影响;（3）通过酵母双杂交筛选获得了一种新的与PGRN相互作用的功能未知的细胞核内蛋白分子FAM76B;（4）通过Co-IP、GST-Pull down及共聚焦显微镜等技术手段证实了PGRN与FAM76B两者之间存在直接的相互作用;（5）通过基因缺失及酵母双杂交技术研究发现,在FAM76B分子中与PGRN发生相互作用的结构域为富含His区域；在PGRN分子中与FAM76B相互作用的结构域主要为GmB及GrmC。上述研究结果为进一步阐明PGRN生物学功能的分子机制及其在FTLD-U中的作用机制奠定了重要基础。