背景随着生活水平的提高,肥胖变的更普遍,由肥胖导致的疾病如2型糖尿病的发病率也在上升,这一趋势给医疗保健和政府带来巨大负担。肥胖时,发生2型糖尿病,主要是由于能量代谢紊乱造成的。提供能量的物质主要有葡萄糖和脂肪酸,它们在线粒体内被氧化后生成水和二氧化碳,同时释放能量,驱动ATP合酶产生ATP[1],供机体各种生理活动所需要。线粒体复合体V(ATP合酶)是产生ATP的分子动力,也决定着线粒体的主要功能。在ATP合酶活性的调节中,其生理抑制因子(ATP synthase inhibitory factor 1,ATPIF1)起着至关重要的作用。ATPIF1与ATP合酶结合,同时抑制ATP合酶的合成作用和水解作用,从而维持细胞内的ATP水平。之前的研究显示细胞内ATP水平升高引起胰岛素抵抗。我们在前期工作的基础上假设ATPIF1基因敲除小鼠组织中ATP水平升高可能导致胰岛素抵抗。本实验的目的是验证ATPIF1基因敲除小鼠组织中ATP水平升高与胰岛素抵抗之间的因果关系。目的通过CRISPR/Cas9技术构建ATPIF1基因敲除小鼠模型,研究在髙脂饮食条件下,ATPIF1基因敲除对细胞内ATP水平和胰岛素抵抗的影响。方法1.动物模型的建立:12周龄的ATPIF1基因敲除雌鼠(以下称为KO小鼠)和同年龄段的C57BL/6品系的雌鼠(以下称为WT小鼠),饲养于湿度40%~50%、温度(24±1.0)℃的独立通气笼系统,昼夜比为12h/12h。两组小鼠均给予髙脂饲料喂养。2.小鼠能量代谢的检测方法:(1)小鼠体重的测量:从喂髙脂饮食的第0周开始测量小鼠体重,每周测量一次,看ATPIF1基因敲除对体重变化的影响。(2)小鼠摄食量的测量:在髙脂饮食的第1周和第7周分别测小鼠的摄食量,观察ATPIF1基因敲除对摄食量的影响。(3)小鼠胰岛素水平的测量:在髙脂饮食的第5周和第26周,用Insulin ELISA试剂盒检测小鼠血浆胰岛素水平和C肽水平,检测ATPIF1基因敲除对胰岛素分泌水平的影响。(4)胰岛素抵抗指标的检测:在髙脂饮食的第12周,13周,分别检测其空腹血糖,胰岛素耐量,葡萄糖耐量,胰岛素抵抗的稳态模式评估,观察ATPIF1基因敲除对胰岛素敏感性的影响。(5)小鼠代谢笼指标的检测:在髙脂饮食的第19周,用代谢笼检测小鼠代谢指标,检测ATPIF1基因敲除对小鼠基础代谢率的影响。3.机制研究的方法(1)组织化学检测肝脏脂滴累积情况:高脂饮食26周后,对其肝脏进行H&E染色,观察细胞的形态和脂滴累积情况。(2)小鼠原代细胞培养:33m M高糖培养基诱导原代细胞,模拟小鼠的髙脂饮食条件,然后检测细胞内ATP水平及甘油三酯的聚积,检测ATPIF1基因敲除对细胞内ATP水平和脂肪细胞分化的影响。(3)蛋白质免疫印迹技术:验证ATPIF1基因敲除的结果和ATPIF1敲除以后对胰岛素抵抗的影响。(4)Seahorse检测组织线粒体呼吸链功能:在正常饮食8周以后,检测呼吸链中的复合体Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的功能,看ATPIF1基因敲除对线粒体功能的影响。结果1.小鼠体重变化趋势:KO小鼠对髙脂饮食比较敏感,并且发现皮下脂肪块,性腺脂肪块,肝脏的重量比WT小鼠的相应组织要重。2.代谢笼和骨密度检测:KO小鼠代谢率是降低的。骨密度结果显示,与WT小鼠相比,KO小鼠的脂肪重量占体重的比值大。3.胰岛素分泌检测:KO小鼠的胰岛素水平和C肽水平均高于WT小鼠。4.胰岛素抵抗指标的检测:KO小鼠胰岛素抵抗现象更加明显。5.原代细胞培养结果:在33m M高糖培养基诱导脂肪细胞成熟时,随着诱导的进展,KO小鼠的原代细胞中高水平的ATP逐渐降低,但甘油三酯的聚积比WT多,说明诱导前KO小鼠原代细胞中的高水平ATP促进了甘油三酯的储存。6.Seahorse检测正常饮食条件下KO小鼠和WT小鼠的肝脏和肌肉中线粒体体复合体Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的功能,结果显示两者没有差异。这说明在正常饮食条件下,与WT小鼠相比,KO小鼠的线粒体功能没有明显的变化。结论ATPIF1基因敲除小鼠表型结果提示,在肥胖条件下,细胞内ATP升高促进小鼠产生胰岛素抵抗。在肥胖前,细胞内ATP水平降低,增加肥胖危险。