研究背景结直肠癌是一种严重威胁人们健康的常见消化道恶性肿瘤。近些年来我国结直肠癌发病率呈明显上升趋势,特别在城市里和发达农村地区,特别是以结直肠癌更为明显。随着人们生活方式和饮食结构的改变,结直肠癌的危险性还会进一步增加。因此结直肠癌发病机制以及防治策略的研究有十分重要意义。从正常细胞发展成为恶性肿瘤是一个长时间而复杂的过程,涉及多阶段、多步骤、多基因作用。随着肿瘤分子生物学研究的深入,发现越来越多的基因改变参与到结直肠癌发生、发展过程,包括癌基因的激活、抑癌基因的失活和错配修复基因的突变等方面,其中从正常粘膜→腺瘤→癌变的途径是最重要的发生模式,探索上述过程中的基因表达改变对于我们对结直肠癌发病机理、防治有着重要意义。抑癌基因的异常在结直肠癌的发生发展中起关键作用,其失活或缺失可导致细胞去调节性生长,克隆性扩张。DCC基因是当前发现的最长的人类抑癌基因。DCC基因定位于18q21.3,基因全长为1400Kb,含29个外显子,其cDNA编码1447个氨基酸的跨膜蛋白,含有转录启始部位、信号肽基因以及编码跨膜蛋白的基因区域。DCC基因经转录和翻译产生的DCC蛋白主要由细胞浆内(325个氨基酸)和细胞浆外(1100个氨基酸)两部分组成。DCC蛋白参与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用,使细胞维持正常的生长和分化方式。当DCC基因发生缺失和突变之后,DCC蛋白生成障碍,细胞的生长和分化紊乱促使细胞朝着恶性方向演变。本文从以下四方面探讨DCC基因在结直肠癌肿的作用及化疗药对其影响。实验方法1采用免疫组化检测DCC基因在结直肠癌中的表达目的探讨DCC基因在大肠癌中表达的生物学意义。方法应用免疫组化方法检测120例大肠癌组织DCC基因蛋白表达。结果DCC蛋白与肿瘤分布无关,结肠和直肠表达无相关性,P>0.05,无统计学意义。DCC基因在高分化肿瘤中比中或低分化的表达高,P<0.05,有统计学意义。DCC蛋白在A、B期比C、D期表达高,并与Dukes分期相关,有转移组明显低于无转移组,P<0.05,有统计学意义。结论DCC表达缺失与大肠癌的侵袭、转移能力密切相关,可反映大肠癌的预后。可作为判断大肠癌生物学行为的一个指标。2 DCC基因表达载体的构建及其对人结直肠癌SW1116细胞株生物学行为的影响目的研究外源性DCC基因稳定转染对人结直肠癌SW1116细胞株的作用。方法采用RT-PCR的方法从人正常结肠组织中扩增DCC基因功能区片段,构建了pcDNA3.1(+)-DCC重组质粒并鉴定。将重组质粒转染入DCC基因缺失的结直肠癌SW1116细胞中,用MTT法观察可抑制结直肠癌细胞SW1116的作用；用Western-blot方法和免疫荧光方法研究pcDNA3.1(+)-DCC质粒转染人结直肠癌细胞SW1116后对结直肠癌细胞的影响及CEA表达。结果采用RT-PCR的方法从人正常结肠组织中扩增DCC基因功能区片段,长度为335bp的扩增产物。将DCC基因功能区片段PCR产物,与pMD18-T载体连接,转化JM109感受态细胞,酶切鉴定含阳性重组质粒的菌落,在335bp出现了目的条带,说明该菌含有pMD18-T-DCC重组质粒。对该质粒插入片段进行DNA序列测定,将测序结果与目的基因比对,结果完全正确。PCDNA3.1(+)-DCC重组质粒的构建和扩增：将pcDNA3.1(+)质粒进行同样的双酶切,琼脂糖凝胶电泳,回收载体片段；将DCC基因片段和pcDNA3.1(+)载体片段进行连接,转化入JM109感受态细胞,酶切鉴定含阳性重组质粒的菌落。扩大培养pcDNA3.1(+)-DCC JM109菌种和pcDNA3.1(+)JM109菌种,得到了高浓度的pcDNA3.1(+)-DCC质粒(1.55μg/μl)和pcDNA3.1(+)质粒(1.12μg/μl)。转染pcDNA3.1(+)-DCC质粒抑制结直肠癌细胞SW1116的增殖：用pcDNA3.1(+)-DCC质粒和pcDNA3.1(+)质粒转染SW1116细胞,于转染后1、2、3、4、5、6天消化细胞,计数,绘制细胞生长曲线。结果转染pcDNA3.1(+)-DCC质粒的SW1116细胞在转染后第3-6天,其细胞数显著低于转染pcDNA3.1(+)质粒的SW1116细胞和正常细胞对照(P<0.05),转染pcDNA3.1(+)-DCC质粒的SW1116细胞生长增殖速度低于转染pcDNA3.1(+)质粒的SW1116细胞和正常细胞对照。用MTT比色法于转染后1、2、3、4、5、6天检测细胞活力,结果表明转染pcDNA3.1(+)-DCC质粒的SW1116细胞在转染后第2-6天,其总细胞活力显著低于正常细胞对照(P<0.05);转染pcDNA3.1(+)-DCC质粒的SW1116细胞在转染后第2、4、5、6天,其总细胞活力显著低于转染空质粒对照(P<0.05)。结果说明,转染DCC基因可抑制结直肠癌细胞SW1116的增殖。转染pcDNA3.1(+)-DCC质粒抑制结直肠癌细胞SW1116表达CEA：用pcDNA3.1(+)-DCC质粒和pcDNA3.1(+)质粒转染SW1116细胞,于转染后第96h固定细胞,免疫荧光染色检测CEA表达。CEA经免疫荧光染色后在紫外灯下呈黄绿色荧光,转染pcDNA3.1(+)-DCC质粒的SW1116细胞呈黄绿色荧光的细胞数量和荧光强度,明显低于转染pcDNA3.1(+)质粒的SW1116细胞和对照细胞。结果说明,转染DCC基因能下调SW1116细胞表达CEA。结论从人正常结肠组织中钓取、扩增DCC基因功能区片段,构建了pcDNA3.1(+)-DCC重组质粒。MTT试验证实转染pcDNA3.1(+)-DCC质粒的SW1116细胞在转染后可抑制结直肠癌细胞SW1116的增殖作用；用Western-blot方法和免疫荧光方法证实pcDNA3.1(+)-DCC质粒转染人结直肠癌细胞SW1116,转染pcDNA3.1(+)-DCC质粒使SW1116细胞增殖速度降低,并且使CEA表达下调。转染DCC基因能抑制结直肠癌细胞的生长增殖,降低CEA表达,从而降低结直肠癌细胞的浸润转移能力。3结直肠癌中DCC基因启动子甲基化及其临床意义目的探讨DCC基因启动子甲基化在结直肠癌发生发展过程中的作用及其临床意义。方法采用RT-PCR方法检测DCC基因表达,用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测DCC基因启动子甲基化。结果DCC基因启动子甲基化在癌组织和癌旁组织、正常组织之间存在显著的差异,P<0.05。在结直肠癌组织中DCC基因甲基化启动子甲基化频率与浸润深度无关,无统计学意义(P>0.05)；而与肿瘤组织分化程度相关,DCC基因启动子甲基化频率在低或未分化组高于高或中分化组,有统计学意义(P<0.05)；与肿瘤临床分期密切相关,C和D期组高于A和B期,有统计学意义(P<0.05)结论DCC基因启动子甲基化和DCC蛋白表达在正常组织,结直肠癌的癌旁组织和原发癌灶间存在显著的差异,DCC基因启动子甲基化频率与肿瘤组织分化程度、肿瘤临床分期相关,参与结直肠癌的发生发展,可作为判断结直肠癌生物学行为的一个指标,将可能为结直肠癌的诊断和治疗提供新的生物学标记和肿瘤基因治疗的靶点。4化疗药对结直肠癌细胞株SW1116中DCC基因影响目的探讨常用化疗药对结直肠癌细胞株SW1 116中DCC基因的影响。方法应用RT-PCR法和Western-Blot法检测化疗药对结直肠癌细胞株SW1116中DCC基因转录和蛋白表达。结果采用RT-PCR法和western-blot法杂交出的特异性条带的灰度值高低来判断化疗药物作用对结直肠癌细胞株SW1116中DCC基因的影响。从基因转录水平和蛋白水平观察：DDP和5-FU作用结直肠癌细胞株SW1116,5-FU可以促进DCC基因转录和蛋白的表达,40μg/ml开始上升,80μg/ml表达量最高,随着浓度的增加,DCC基因的转录开始下降,细胞生长明显减慢,160μg/ml达低值。DDP可以促进DCC基因转录和蛋白的表达,1.5μg/ml开始上升,3.0μg/ml表达量最高,随着浓度的增加,DCC基因的转录开始下降,细胞生长明显减慢,6μg/ml达低值。选取最佳浓度5-Fu:80μg/ml; DDP:3.0μg/ml作用不同时间对结直肠癌细胞株SW1116中DCC蛋白表达的影响。可以观察到在两者在6小时DCC蛋白开始上调,12小时更加明显,表达量最高,以5-FU为明显,细胞生长明显减慢,24小时达低值。以上结果表明常用化疗药物可以上调结直肠癌细胞株SW1116中DCC的表达量。结论应用RT-PCR法和Western-Blot去检测化疗药对结直肠癌细胞株SW1116中DCC基因在不同浓度,不同时间的基因转录和蛋白表达。从基因转录水平和蛋白水平观察：化疗药可以促进DCC基因转录和蛋白表达,常用化疗药物可以上调结直肠癌细胞株SW1116中DCC表达量,说明调控DCC基因的表达是该化疗药的抗癌作用机制之一。因此,DCC基因有望成为一个有效的靶基因。