人和动物的生长发育离不开外界环境,而人类在生产和生活中造成的环境污染对人和动物健康的危害日益严重。工业革命以来,随着环境污染的加剧,环境内分泌干扰物(EEDs)导致的内分泌、生殖系统的疾病日趋严重。EEDs可以通过受污染水源、食物或经皮肤吸收进入机体,干扰内源性激素的合成、释放、转运或代谢而影响内分泌系统的功能,破坏机体内环境的协调与稳定。4-硝基苯酚(PNP)是一种重要的有机合成原料,主要用作农药、医药、染料等精细化学品的中间体。环境中PNP污染主要来源于工农业生产、汽车尾气颗粒物质以及杀虫剂对硫磷和甲基对硫磷代谢产物。PNP已被证实为EEDs,能够扰乱机体正常内分泌活动,尤其是生殖功能。当前我国大气污染非常严重,雾霾天气频繁出现,严重危害国民健康,而汽车尾气是导致雾霾天气的重要原因之一,我们前期的研究证明汽车尾气中含有大量的PNP,但是我们对PNP的生殖毒性研究较少,结合当前我国大气污染的现状,进一步明确PNP的生殖毒性具有重要的现实意义。氧化应激可能是EEDs生殖毒性的作用机理之一。体内外多种因素可扰乱睾丸组织的抗氧化系统,导致睾丸氧化应激。因此探索能够预防及缓解氧化应激的方法是防治EEDs诱导生殖毒性有效途径之一。转录因子NF E2相关因子2(Nrf2)是近几年被发现在调控抗氧化应激损伤方面起到重要作用的信号通路。Nrf2通过调控Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白的表达来保护细胞抵御不良因子的侵害。植物甾醇(PS)是一种新型饲料添加剂,具有抗氧化、抗癌、抗炎、类雌激素及免疫调节等多种生物学功能。本研究首先分析了不同浓度PNP对大鼠睾丸的损伤作用,然后采用IHC.RIA和RT-PCR等方法检测分析了ER、AR和Nrf2蛋白在大鼠睾丸组织中的表达,同时测定分析了PNP处理大鼠睾丸氧化应激参数,Caspase-3阳性表达细胞数量,并就PS对PNP诱导的大鼠生殖毒性损伤的缓解作用进行了初步探讨。主要研究结果如下：1.低剂量PNP皮下注射对雄性大鼠生殖内分泌的干扰作用PNP是一种公认的EEDs,具有拟雌激素和抗雄激素活性,为研究PNP对雄性未成年大鼠的生殖内分泌干扰作用,试验采用20只SPF级雄性未成年SD大鼠,随机分为4组,连续4周皮下注射PNP(0、0.1、1和10mg/kg),对照组注射等量的溶剂(PBS+0.05% tween80)。最后一次染毒后24 h,采集血样,称取睾丸等脏器湿重并计算脏器指数；检测附睾尾精子数量和畸形率；采用RIA方法检测血清中睾酮和雌二醇水平；多聚甲醛固定睾丸组织后进行石蜡切片,采用HE和IHC的方法观察PNP对大鼠睾丸的病理损伤及其对AR、ERa和ERβ蛋白表达的影响；RT-PCR检测各受体及芳香化酶mRNA的表达。结果显示PNP处理组大鼠与对照组相比较,体重、睾丸重和睾丸指数均无显著性差异(P>0.05)；附睾尾精子数量和畸形率无显著性差异(P>0.05)；但10 mg/kg PNP组大鼠血清睾酮水平显著升高,并伴随睾丸间质细胞增生(P<0.05),而雌二醇水平和芳香化酶表达显著下降(P<0.05)。另外,与对照组相比,10 mg/kg PNP组大鼠睾丸AR、ERa表达显著增加(P<0.05), ERβ和芳香化酶表达显著降低(P<0.05). AR、ERa和ERα在睾丸中的表达说明雌二醇和睾酮对生殖细胞具有直接作用。AR、ERa和ERp表达的不同变化可能是源于PNP的直接作用,也可能是PNP诱导雌二醇/睾酮变化和间质细胞增生后的间接作用。因此,多末端测定是全面评价环境内分泌干扰物风险的必要手段。2.低剂量PNP皮下注射对雄性大鼠肾上腺皮质功能的影响为研究PNP对雄性大鼠肾上腺皮质功能的影响,体内试验采用20只SPF级雄性未成年SD大鼠,随机分为4组,连续2周皮下注射PNP(0、0.1、1和10 mg/kg),对照组注射等量的溶剂(PBS+0.05% tween80).最后一次染毒后24 h,采集血样,RIA方法测定孕酮、睾酮和雌二醇水平,采集各脏器称重,HE染色观察PNP对大鼠肾上腺的病理损伤,RT-PCR检测肾上腺皮质类固醇合成关键酶的表达；体外试验利用肾上腺皮质细胞原代培养,细胞贴壁后,用不同PNP浓度(0、10-6、10-5、10-4M)培养液培养24 h,台盼蓝镜检细胞活率,RIA测定细胞培养液中孕酮水平。体内试验结果显示PNP处理组大鼠与对照组相比较,体重、各脏器重和脏器指数均无显著性差异(P>0.05)；10 mg/kg PNP组大鼠血清睾酮水平显著升高(P<0.05),而孕酮水平显著降低(P<0.05),雌二醇水平差异不显著(P>0.05)；组织学检查并未发现染毒组肾上腺皮质形态异常,但RT-PCR结果显示肾上腺组织中StAR和P450c17表达显著增加(P<0.05),而3β-HSD mRNA表达显著降低(P<0.05), P450scc差异不显著(P>0.05)。体外试验结果显示,与对照组相比,染毒组细胞活率未见明显异常,但培养液中孕酮水平显著降低(P<0.05)。结果表明,PNP主要通过影响肾上腺类固醇合成酶的表达来影响肾上腺皮质类固醇激素分泌功能。3.高剂量PNP皮下注射对大鼠睾丸组织学损伤及PS的缓解作用多数EEDs在低剂量时表现为内分泌干扰活性,而高剂量时又表现为一般毒物的毒性危害作用。PS是一种新型饲料添加剂,具有高效的抗癌、抗炎活性。为研究高剂量PNP对大鼠睾丸组织学损伤和PS介导的缓解效应,试验采用20只SPF级雄性未成年SD大鼠,随机分为4组(对照组,50 mg/kg PS,100 mg/kg PNP,50 mg/kg PS +100 mg/kg PNP), PNP连续4周皮下注射,对照组注射等量的溶剂(PBS+0.05%tween80),PS添加于日粮,预饲一周并伴随整个试验过程。最后一次染毒后24 h,称重,无痛处死大鼠,采集血样,称取睾丸等脏器湿重并计算脏器指数；检测附睾尾精子数量和畸形率；采用RIA法检测血清中睾酮和雌二醇水平；多聚甲醛固定睾丸组织后进行石蜡切片,采用透射电镜以及IHC染色的方法观察PNP对大鼠睾丸的病理损伤及其对Caspase3蛋白表达的影响。结果表明,与对照组相比,PNP处理组大鼠体重、睾丸重和睾丸指数均无显著性差异(P>0.05)；附睾尾精子畸形率无显著性差异(P>0.05),但精子数量显著性降低(P<0.05)；血清雌二醇水平未见显著性影响,但睾酮水平显著降低(P<0.05)；饲粮中添加PS使PNP导致的危害得到不同程度缓解。另外,透射电镜观察睾丸细胞超微结构发现,PNP使大鼠睾丸生精小管的超微结构发生变化,多种细胞的细胞器出现损伤,包括支持细胞和精原细胞空泡、生殖细胞核固缩以及出现凋亡小体等典型细胞凋亡症状、精子细胞线粒体鞘缺失和精母细胞脂滴沉积等。同时,Caspase3 IHC染色结果显示,PNP组大鼠睾丸细胞凋亡显著增加(P<0.05),而PS缓解了PNP引起的生殖细胞凋亡。结果说明,100 mg/kg PNP导致大鼠睾丸组织学损伤,而PS对这些损伤具有一定的缓解作用。4.PS对高剂量PNP诱导大鼠睾丸氧化应激的缓解作用氧化应激是有毒化学物质引起机体毒性损伤的途径之一。新型饲料添加剂PS具有高效的抗氧化活性；Nrf2是近几年被发现在调控抗氧化应激损伤方面起到重要作用的信号通路。为研究高剂量PNP引起的大鼠睾丸组织氧化应激和PS介导的缓解效应,试验采用20只SPF级雄性未成年SD大鼠,随机分为4组(对照组,50 mg/kg PS, 100 mg/kg PNP,50 mg/k(g PS+100 mg/kg PNP),PNP连续4周皮下注射,对照组注射等量的溶剂(PBS+0.05％tween80),PS添加于日粮,预饲一周并伴随整个试验过程。最后一次染毒后24 h,采集血样,检测血清抗氧化水平；多聚甲醛固定部分睾丸组织后进行石蜡切片,采用IHC和蛋白免疫印迹的方法观察PNP对大鼠睾丸Nrf2蛋白表达的影响；部分睾丸组织保存于液氮中,用于检测睾丸组织中抗氧化水平和Nrf2及其相关调控基因的表达。结果表明,与对照组相比,PNP处理组大鼠血清和睾丸中MDA和H202水平显著升高(P<0.05),而SOD,CAT,GSH和GSH-Px含量显著降低(P<0.005)。RT-PCR结果显示,PNP使Nrf2 mRNA表达降低(P<0.05.,HO-1、 GCLC mRNA表达增加(P<0.05),对NQO1 mRNA表达没有显著影响(P>0.05)。IHC和蛋白免疫印迹结果显示,PNP诱导Nrf2蛋白的表达以及解离入核。饲粮中PS的添加使上述指标得到一定程度的恢复,但是并未达到正常水平,另外饲粮添加PS促进了Nrf2蛋白的表达以及解离入核。试验结果表明,PNP诱导雄性大鼠氧化应激,Nrf2信号通路在PNP诱导的睾丸氧化应激中起重要作用；饲粮添加PS可以一定程度地缓解PNP诱导的氧化应激。5.PNP睾丸注射对大鼠的生殖毒性及PS的缓解作用为研究PNP对大鼠睾丸的直接毒性作用和PS介导的缓解效应,试验采用45只SPF级雄性成年SD大鼠,随机分为3组(对照组,10-1 M PNP,50mg/kg PS+10-1 M PNP),单次睾丸注射PNP,每侧50 μl,对照组注射等量的溶剂(PBS+0.05% tween80), PS添加于日粮,预饲一周并伴随整个试验过程。分别于1、3天和7天采样,称重,无痛处死大鼠,采集血样,称取睾丸等脏器湿重并计算脏器指数；检测附睾尾精子数量和畸形率；采用RIA检测血清中睾酮水平；多聚甲醛固定睾丸组织后进行石蜡切片,HE染色和IHC观察PNP对大鼠睾丸的病理损伤及其对Nrf2和Caspase3蛋白表达的影响,液氮保存睾丸检测抗氧化水平和Nrf2及其主要调控基因的表达。结果表明,与对照组相比,PNP处理组大鼠体重、睾丸重和睾丸指数均无显著性差异(P>0.05)；附睾尾精子储备无显著性差异(P>0.05),但精子畸形率在第7天显著性增加(P<0.05)；血清睾酮水平在第1天显著升高(P<0.05)；HE染色结果显示PNP注射组在第1天出现局部炎性细胞浸润,部分曲细精管管壁损伤,第3天部分曲细精管中出现脱落的生殖细胞,第7天部分曲细精管中精细胞缺失；IHC染色结果显示,睾丸注射PNP使caspase-3在第1天表达增加,第3天达到顶峰,而在第7天又相对降低。睾丸注射PNP使睾丸中SOD活性在第1和3天显著升高(P<0.05),而MDA水平在第3天显著增加(P<0.05), CAT活性在第1天显著升高(P<0.05),而H2O2水平在第三天显著增加(P<0.05), GSH水平在第7天显著减少(P<0.05), GSH-Px活性在第1天显著升高(P< 0.05). Nrf2在睾丸注射PNP大鼠睾丸中大量表达,其中以第1天表达最为强烈,第3和7天相对略有减弱,说明Nrf2抗氧化信号通路在注射PNP后被迅速激活；RT-PCR结果显示,睾丸注射PNP使Nrf2和HO-1 mRNA在第7天表达显著增加(P<0.05), GCLC mRNA在第3天表达显著升高(P<0.05)。值得注意的是,饲粮添加PS对PNP引起的氧化应激仍然具有一定的缓解作用,但是效果不及皮下注射PNP模型中显著。结果表明睾丸注射PNP能诱导睾丸氧化应激,使Nrf2抗氧化信号通路迅速启动,并且Nrf2表达具有时间依赖性,但其机理仍不明确,需进一步研究。