NOD样受体家族CARD结构域包含分子5 (NLR family, CARD domain containing 5, NLRC5)在调控天然免疫和细胞免疫中发挥重要作用,到目前为止,NLRC5已经被证实在人和小鼠中可以调控MHCI类分子的表达,并对NF-κB以及I型干扰素分子通路具有抑制性调控作用。白痢沙门氏菌病是我国家禽养殖重要的细菌性疾病之一,该病的爆发给家禽生产造成严重的经济损失。白痢沙门氏菌的隐性感染和携带状态的形成会导致重复发病进而防治困难。白痢沙门氏菌侵入鸡体内后,会抑制MHC Class I以及诱导IL10表达,这一机制是阻断清除的过程从而导致携带状态和持续感染状态的原因之一。鸡NLRC5分子可能与沙门氏菌清除的分子机理有关。截止目前雏鸡感染白痢沙门氏菌后组织水平的高通量研究尚无报道,其他菌株由于致病性和病理机制的差异仅能提供部分参考,因此有必要专门对鸡白痢沙门氏菌感染过程中的表达谱变化进行系统研究,并在此基础上进一步研究家禽NLRC5及相关基因的表达规律以及启动子缺失对NLRC5表达的影响,从而分析其受调控的可能机制,以帮助建立家禽的NLRC5调控的机制模型,更好的理解家禽白痢沙门氏菌隐性感染形成的机制以及细菌性病原清除的机理。研究内容和结果如下。1.第二章第一节,比较不同沙门氏菌菌种感染导致雏鸡的脾脏和盲肠发生的表达谱变化。通过安捷伦鸡全基因组表达谱芯片,分别对7dpi感染了白痢、肠炎还有poly(I:C)的雏鸡脾脏和盲肠进行了表达谱分析,同时检测IL-la, IFNy, IgG和IgM浓度,肠道载菌量和免疫荧光鉴定脾脏载菌量。结果表明,病原刺激激发了系统性沙门氏菌感染的主要特征性免疫反应。在白痢沙门氏菌感染组中,脾脏表达谱富集分析结果显示,差异表达基因主要富集于淋巴细胞的分化和增殖过程,因而呈现出获得性免疫的有效激活状态；其中与Thl淋巴以及NK细胞激活有关的重要分子诸如IL15, CD28等均呈现下调,而与B淋巴细胞活化有关的基因例如IL7呈现上调。这表明细胞免疫的清除作用一定程度上已经受到了抑制,而B细胞所参与的抗体反应被激活。而感染白痢沙门氏菌组的盲肠组织中,下调基因主要与天然性免疫系统有关,表明相关天然性免疫反应或细胞免疫反应活性的减弱,推测可能与抗体的保护作用增强有关。第二章第二节,在证实白痢沙门氏菌感染过程在7dpi造成细胞免疫功能衰弱的基础上,然后利用时间序列表达谱分析白痢沙门氏菌感染雏鸡后2小时、4小时、8小时、24小时、3天、5天、7天、12天、21天脾脏组织中重要的分子事件。同时测定体重、脾脏指数、法氏囊指数、胸腺指数、以及IL-1α、IFNγ、IgG和IgM浓度。通过WGCNA的表型关联分析,以及探针间的共表达特征,韦恩分析等方法挖掘导致隐性感染和携带的差异表达基因。时序表达谱的分析初步探明了在白痢沙门氏菌感染的关键时期脾脏组织中表达谱发生的变化,观察到了天然免疫到体液免疫发展变化过程中脾脏组织中重要的分子事件,包括淋巴细胞的激活,增殖和迁移事件；并鉴定出大量关键调控基因,例如MHC class I B-F, ANXA13, IL18, BF2, TNFRSF13B, BLB2以及CD28等；富集通路中的基因呈现两类高度负相关的功能团；差异表达基因中的节点基因的表达模式与脾脏指数高度正相关；在不同阶段中免疫反应有关的通路表现出与其他信号通路和代谢通路不同的关联特征；差异表达基因大多数均可以定位在有报道的与家禽抗体滴度有关的QTL区域内；NLRC5是差异表达基因；3dpi-5dpi是天然性免疫抑制和细胞免疫激活的关键阶段,也是病原清除的主要时期,该阶段的差异表达基因表达趋势反应了雏鸡对病原做出免疫反应的特征；NLRC5的表达模式表明NLRC5的翻译和激发的下游通路促进了细胞免疫反应和病原的清除作用,但同时可能也受到了负调控因素的调控。第二章第三节,进而基于上述试验提供的表达谱芯片数据,以及NLRC5对MHCI已知的调控作用的假设,开展针对NLRC5在表达谱数据中的共表达分析,尝试找到重要的共表达分子。共表达分析结果显示,NLRC5与TAP1和IL21R高度共表达,其中作为MHCI区域中的分子TAP1可能在受到NF-κB调控的同时也受到NLRC5的影响。2.第三章第一节,鉴于NLRC5基因功能的重要性及其在鸡白痢沙门氏菌感染过程中的表达与调控功能,本研究进一步对鸡NLRC5基因功能进行研究。首先,克隆了鸡NLRC5的全长CDS以及UTR序列,并对其进行细致的生物信息学分析。在组织水平对有报道可能与NLRC5功能相关的基因进行荧光定量的检测和分析。第三章第二节,随后基于克降的片段构建过表达和干扰载体,转染DF1细胞系,并构建稳定表达株。在此基础上首先进行细胞免疫荧光鉴定,然后对细胞进行了LPS刺激,以观察相关基因表达变化的趋势。最后在稳定表达细胞株上对NLRC5以及信号通路中的关键基因的表达模式进行了比较和分析,并提出了NLRC5及重要相关基因的假设调控机制。NLRC5克隆和分析结果显示,鸡NLRC5与哺乳动物NLRC5基因具有一定的同源性,推测可能和哺乳动物该基因功能一致,可以进入核内发挥作用,并受到表观遗传修饰的影响。NLRC5及其信号通路中的关键基因在组织和细胞中的表达研究发现,NF-κB2与NLRC5有显著的线性共表达关系,鸡的STAT1与NLRC5没有明显的共表达特征,推测可能对NLRC5的调控作用较复杂或可能没有调控作用,而STAT3可能作为NF-κB2的负调控因子负反馈调控了NLRC5的表达。综上,除MHCI外,NLRC5可能调控了STAT3和IL18的转录表达。家禽NLRC5可能具有与哺乳动物不同的表达调控机制。3.第四章,为进一步弄清NLRC5受到调控的具体过程,以及进一步证明鸡NLRC5对MHCI的调控作用,进而帮助更好的开展SPI-2 Ⅲ型分泌系统对隐性感染和携菌状态形成作用的研究奠定基础,本研究初步探索了NLRC5起始密码子前4372bp区域不同片段的活性,并分析其潜在的可能调控原理。NLRC5的系列缺失结果证明,NLRC5可能具有2个有活性的启动子区域,并且通过617到1448之间的区域隔离两个启动子的活性；第二个启动子活性要强于第一个启动子活性,并且在该区域内发现了NF-κB等有报道与NLRC5表达调控有密切相关的转录因子的结合基序,1448到4372的片段可能是脾脏组织中的发挥作用的主要启动子,转录表达主要从2108开始的NLRC5分子片段；下游调控可能较为复杂并且下游元件对NLRC5的表达有显著的影响；1-2108的活性仅为1448-4372的50%左右,这表明1448-2108的活性要比1828到2108的活性低,因而推测,1828到2213的活性会进一步增强,甚至超过1448到4372的活性,因此认为NLRC5的核心启动子主要为1828到2213的片段,该区间包含的元件可能有STAT1、NF-κB、P300、MRF2、FAC1、 PAX5、CRFB、CPBP、NF-AT1、MRF-2、AML1、FAC1、CRX、RelA-p65。其中STAT1和NF-κB均于转录起始位点前182bp起始的位置被鉴定出来。未来,研究需确认家禽NLRC5对MHCI调控的机制,通过更进一步的ChIP,乃至ChIP-Seq对NLRC5结合启动子区域进行全基因组的分析,结合RNA-Seq分析可以更准确的弄清该基因是否对STAT3, MHCI以及IL18等基因存在调控作用,再通过EMSA,点突变以及敲除和过表达实验来进一步的确认NLRC5可能存在的调控机制。最终转入白痢沙门氏菌SPI-2 Ⅲ型分泌系统对巨噬细胞中MHCI有关通路的调控作用的研究,以期揭示白痢沙门氏菌隐性感染和携带状态形成的具体机制。