论文部分内容阅读
茶氨酸为茶树特有的非蛋白质氨基酸，催化其合成的关键酶尚未研究清楚。RNAi是双链RNA的衍生复合物诱导同源基因mRNA降解的转录后基因沉默技术。在本实验室构建的茶树幼根cDNA文库中，获得GS1-1基因（contig47）的EST序列，通过实时荧光定量PCR技术验证该基因可能与茶氨酸合成相关。利用GS1-1基因的3-UTR及其邻近区域构建RNAi载体进行茶树叶片遗传转化，以期进一步解释茶氨酸生物合成机制。主要结论如下：1、茶氨酸合成相关基因GS1-1的RNAi载体构建。在本实验室获得茶氨酸合成相关基因GS1-1的EST序列的基础上，通过SMART RACE技术获得其3’-端全长序列。选取3-UTR及其邻近区一段长350bp序列为干涉的目的片段，再从载体pJawohl8上选取一段大小为500bp的内含子序列（茶基因组内无）为填充片段，运用“零背景克隆”技术构建出“发夹”结构，通过验证该结构正确。将其重组到植物表达载体pCAMBIA2301上，转化到农杆菌EHA105中，成功构建出RNAi载体pCAM-RNAi-GS。2、龙井-43叶片愈伤诱导最佳激素浓度及抗生素浓度筛选的研究。由于茶树再生困难，选取龙井43叶片作为遗传转化受体材料。叶片在1/4MS+TDZ0.1μmol·L-1+IBA0.49μmol·L-1+2,4-D0.005mg·L-1的培养基上培养60d后，愈伤组织诱导率最高达96%。将叶片置于含不同浓度卡那霉素的培养基上培养，获得龙井-43的卡那霉素抗性标记筛选浓度为100mg·L-1。3、根癌农杆菌介导转化龙井43叶片。以龙井43叶片为受体材料，预培养3d后用活化的农杆菌EHA105（含RNAi载体pCAM-RNAi-GS）侵染15min，置于YMB培养基中共培养4d，脱菌后置于筛选培养基上培养，获得8块抗性愈伤组织。经GUS组织化学染色和PCR检测验证其中3块（愈伤-4，愈伤-5，愈伤-6）为阳性结果。利用0.05%的三氟乙酸做流动相，高效液相色谱法（HPLC）测定抗性愈伤组织内茶氨酸含量，愈伤-4和愈伤-5茶氨酸含量与对照相比下降了85.09%。