论文部分内容阅读
研究目的肿瘤干细胞,又称肿瘤起始细胞,具有自我更新,多向分化,静息性和可塑性的特点。目前,大多数观点认为肝细胞肝癌治疗效果不理想与肝癌干细胞的存在密切相关。由此,肿瘤干细胞被认为是根治肝细胞肝癌的重要靶标。然而,由于肝癌干细胞在肝癌常规治疗的抵抗以及复发转移中起重要作用,寻找影响肝癌干细胞干性特征的因素及其作用机制,对认识肝癌治疗抵抗以及复发转移的内在机制具有重要意义。研究表明肿瘤微环境对肝癌的发生发展具有重要作用,但对于肿瘤微环境中肝癌干细胞干性维持的具体调控机制目前尚不清楚。作为肿瘤微环境中的重要介质,脂多糖具有促进肝癌发展的作用,可其对肝癌干细胞干性特征的影响少有报道。因此,本实验我们将研究脂多糖对肝癌干细胞干性的影响,并进一步探讨其作用机制。研究内容与方法1、免疫磁珠从人的肝癌细胞系Huh7中分选纯化CD133+细胞,并运用流式细胞术检测CD133+细胞在脂多糖刺激培养至第1周、2周和4周的CD133+细胞比例变化;2、RT-PCR和western blot检测CD133+细胞在脂多糖刺激培养至第1周、2周和4周的CD133表达水平;3、分别在脂多糖刺激培养至第1周、2周和4周三个时间点获取CD133+细胞,然后进行克隆形成实验和皮下成瘤实验,运用实时无标记细胞迁移分析和Transwell检测CD133+细胞的迁移和侵袭能力,并进行化疗抵抗实验;4、RT-PCR和western blot检测脂多糖刺激培养过程中CD133+细胞的HIF-1α表达,并用HIF-1αsi RNA特异性干扰CD133+细胞HIF-1α的表达,然后检测CD133+细胞CD133表达;5、Western blot检测脂多糖刺激培养过程中CD133+细胞NF-κB激活情况,运用NF-κB抑制剂后,RT-PCR和western blotting检测HIF-1α和CD133的表达; 6、运用HIF-1αsi RNA特异性干扰CD133+细胞HIF-1α的表达,然后分别运用实时无标记细胞迁移分析和Transwell检测CD133+细胞的迁移和侵袭能力。研究结果1、分选纯化的CD133+细胞纯度为97.0%,与对照组相比,CD133+细胞在脂多糖刺激培养过程中,流式细胞术检测CD133+细胞的比例呈时间依赖性下降明显延缓;2、CD133+细胞在脂多糖刺激培养过程中,RT-PCR和western blot检测CD133表达情况与流式细胞术检测结果一致;3、脂多糖刺激培养可维持CD133+细胞的单克隆形成能力、成瘤能力、迁移侵袭和化疗抵抗能力;4、脂多糖引起CD133+细胞中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的时间依赖性下降,特异性干扰HIF-1α表达引起CD133+细胞中CD133表达下降;5、运用NF-κB抑制剂可以明显降低由脂多糖引起的HIF-1α和CD133表达;6、运用HIF-1α小干扰RNA可减弱脂多糖对CD133+细胞的迁移和侵袭能力的维持作用。研究结论我们的研究结果表明,脂多糖作为肝癌肿瘤微环境中的重要媒介,通过激活NF-κB/HIF-1α信号通路在CD133+肝癌干细胞的干性维持中起重要作用。