光合作用是光合生物将光能转化为化学能,同时将无机物转化为有机物后贮存在生物体内的过程,是地球生命存在和发展的能量源泉。叶绿体作为光合作用的场所,对光合生物的生长发育起着至关重要的作用。叶绿素作为叶绿体中含量最丰富的光合色素,在光合作用中负责吸收和传递光能。叶绿素等其他色素的合成缺陷会导致植物产生叶色变异。本文通过对实验室拟南芥T-DNA插入突变体库进行筛选,获得了一株叶色黄化的突变体cbd1（chlorophyll biosynthetic deficiency 1）。本论文通过保守性分析和生物信息学预测等对未知基因CBD1的功能进行了探索,从形态特征、色素含量、蛋白定位、叶绿素合成途径中间产物含量、光合特性和离子稳态等方面对该突变体进行了分析,主要研究结果如下:1.CBD1为进化保守的叶绿体跨膜蛋白通过生物信息学预测和系统发育分析发现,CBD1蛋白N端具有叶绿体定位信号肽,且具有六个可能的跨膜区域。CBD1在苔藓植物、蕨类植物和被子植物中进化保守,在裸子植物和古细菌中则没有同源蛋白存在。通过PSI-BLAST保守性分析发现CBD1蛋白属于Type Ⅱ CAAX金属蛋白酶超家族,并具有三个保守的模块。通过对与CBD1共表达基因的功能分析,推测其可能参与叶绿素合成途径与光合作用。本论文利用PEG/Ca2+介导的外源基因瞬时转化拟南芥原生质体和组织化学染色等细胞生物学方法,进一步确认CBD1为定位于叶绿体的类囊体膜并只在绿色组织表达的蛋白,在根中检测不到CBD1的表达。2.CBD1参与叶绿素合成途径的调控cbd1突变体在正常生长条件下出现叶片黄化的表型,其叶绿素含量与野生型相比下降了约30%-40%,其中叶绿素b的下降幅度更大,因而cbd1中叶绿素a/b的比例要明显高于野生型。通过对避光生长的黄化苗的分析中可以看出cbd1的叶绿素合成速率要明显慢于野生型,且CBD1基因的表达受持续光照条件的诱导升高。通过转基因方法以cbd1突变体为背景构建了基因组回补植株,发现该黄化表型可以完全回复。说明该表型的出现确由CBD1的突变引起。本论文通过实时荧光定量PCR和荧光分光光度法分别检测了 CBD1的突变对叶绿素合成途径中编码关键酶的基因表达的影响以及对叶绿素合成途径的中间产物含量的影响。结果发现CBD1的突变影响了叶绿素合成相关基因对光照变化的响应,并且在黄化和正常生长的cbd1突变体中,当分别添加Fe螯合剂DP和叶绿素合成前体物质ALA时,与野生型相比,cbd1中都检测到了 Mg-ProtoⅨ的明显累积。这些结果说明CBD1可能参与并调控了叶绿素合成途径。3.CBD1影响了光系统的组装与光合效率本论文通过蓝绿温和非变性凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析了野生型与cbd1突变体中类囊体膜蛋白组分的变化,实验结果发现,CBD1的突变造成了光系统Ⅰ中叶绿素a结合蛋白PsaA+B和PsaE的积累,同时抑制了捕光色素复合体LHCⅡ三聚体（LHCII-T）的组装,因此影响了cbd1光系统的组装以及对光能的捕获能力。本论文使用脉冲调制式荧光仪对野生型与cbd1突变体进行叶绿素荧光分析,发现cbd1突变体中光系统Ⅱ反应中心的开放程度（Fo）和实际光化学效率（ΦPSⅡ）,以及光系统Ⅰ的实际光化学效率（ΦPSI）都要高于野生型,然而cbd1的非光化学猝灭耗散也明显高于野生型。说明cbd1所吸收的光能并未能有效的转化为光化学能量。4.CBD1影响了叶绿体离子稳态本论文利用Mg2+吸收缺陷型菌株MM281发现CBD1异源表达在MM281中时可以回补该菌株在低镁条件下的生长。通过Percoll法分离野生型和cbd1突变体的完整叶绿体与类囊体并利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）进行离子含量分析,发现cbd1叶绿体与类囊体中的Mg2+含量与野生型相比降低了约40%。说明CBD1的缺失会造成叶绿体镁离子稳态的紊乱。5.CBD1与GUN5的遗传互作本论文通过遗传学方法发现CBD1与镁螯合酶的催化亚基GUN5存在遗传互作,其双突变体cbd1gun5呈现黄化矮小的表型,其叶绿素合成途径和光系统组装都受到严重的抑制。利用透射电镜对cbd1gun5叶绿体超微结构进行分析,发现cbd1gun5的叶绿体和类囊体发育出现了明显的阻滞。综合以上结果,推测CBD1可能参与叶绿素合成途径,并与该叶绿素合成过程中Mg的获取与传递过程相关。因此,对拟南芥CBD1蛋白的研究不仅揭示了一个未知蛋白的生物学功能,还为进一步阐释GUN5的功能以及叶绿素合成途径的调控机制提供了新的思路和方向。