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牡蛎是我国乃至世界重要的海水养殖品种,自1972年在美洲牡蛎中发现了疱疹样病毒,到目前为止,全世界范围内多种双壳贝类中已经检测到牡蛎疱疹病毒-1(Oyster Herpesvirus-1,OsHV-1),并且OsHV-1已被证明与幼虫的大规模死亡有关,在繁育季节幼虫的大规模死亡也为养殖业带来了巨大的经济损失。目前国内外关于牡蛎对OsHV-1的免疫机制的研究还处于一片空白之中,并且对OsHV-1引起的贝类的死亡和病害没有十分有效的解决办法,严重影响了牡蛎养殖业的健康和可持续发展。因此研究牡蛎对OsHV-1的天然免疫反应,从牡蛎机体本身研究其对OsHV-1的免疫防御机制,为预防OsHV-1引起的死亡和病害提供理论基础,也为减少养殖业的的损失提供有力帮助。本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,利用细胞生物学,生物信息学、分子生物学和免疫学等手段,对长牡蛎幼虫和幼贝对OsHV-1的天然免疫反应进行了系统研究,获得的结果如下:TLRs与RLRs是天然免疫防御中重要的模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR),通过RACE技术从长牡蛎中克隆得到了其所属的TLR和RLR信号通路中的关键基因cDNA全长,其中TLR信号通路包括4个TLR基因(分别命名为Cg05421 TLR、Cg17269 TLR、Cg21740 TLR和Cg27513 TLR)和2个接头分子MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88)基因(分别命名为CgMyD88-1和CgMyD88-2),RLR信号通路包括11个RIG-I(Retinoic acid-inducible gene-I)基因(命名为RIG-I-1到RIG-I-11)和一个接头分子MAVS基因(命名为CgMAVS),除此之外还得到了TRAF基因(TNF receptor associated factor)(命名为CgTRAF2和CgTRAF6)和IRF基因(Interferon regutory facror)(命名为Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF)完整的ORF序列。通过SMART结构域分析,发现这些基因大部分具有与脊椎动物同源基因相似的结构域特征,并且氨基酸序列具有一定的相似性,并通过构建进化树分析了这些基因在不同物中的进化地位。通过对长牡蛎生长发育表达谱数据进行cluster分析,挑选表达稳定的cluster中并且与人类管家基因同源的9个基因与长牡蛎中常用的内参基因18srrna(18s),28rrna(28s),elongationfactor-1(ef-1α),β-actin(act)和glyceraldehyde-3phosphate-dehydrogenase(gapdh)共同作为候选内参基因,通过qrt-pcr(quantitativerealtimepcr)技术和genorm软件分析在被oshv-1感染的幼虫样品和未被oshv-1感染的幼虫样品中进行内参基因的筛选,结果表明核糖体蛋白基因rl7与rs18是最适合作为长牡蛎d型幼虫时期和壳顶幼虫时期qrt-pcr的内参基因。在获得最佳内参基因基础上,对4个tlr基因和9个rig-i基因在oshv-1攻毒前后的长牡蛎幼虫样品中,通过qrt-pcr的方法研究其mrna的相对表达量变化,结果表明:3个tlr基因在oshv-1攻毒后壳顶期u2出现峰值,一个tlr基因和9个rig-i基因都在壳顶期u5出现峰值。针对这些结果提出一个假说:三个tlr基因(cg05421tlr、cg17269tlr和cg21740tlr)参与牡蛎幼虫对oshv-1的识别或者介导oshv-1进入牡蛎细胞的细胞膜过程,其蛋白质应该定位在细胞膜上;cg27513tlr基因和rig-i基因参与识别oshv-1进入牡蛎细胞后自身复制产生的中间产物(dna或者rna),其蛋白质定位应该在细胞质内。采用egfp融合蛋白的方法做了4个tlr基因的亚细胞定位实验对这个假说进行验证,结果表明4个tlr基因均定位于细胞质与内涵体中,虽然与假说不符,但是长牡蛎中tlr基因定位于内涵体中发挥作用是国际上的首次报道。另外两个myd88基因cgmyd88-1与cgmyd88-2均定位于细胞质内与其生物学功能相称。为了进一步验证tlr与rlr通路关键基因对oshv-1的免疫防御作用,将含有oshv-1的上清液攻毒长牡蛎幼贝。tlr通路中tlr基因与myd88基因均可被oshv-1诱导上调并且在一些时间点与对照形成显著性差异(p<0.05),并且通过酵母双杂交实验发现cg27513tlr的tir结构域与cgmyd88-2存在蛋白质相互作用,这些结果表明长牡蛎中存在参与oshv-1免疫的依赖myd88的tlr信号通路;rlr通路中rig-i基因与mavs基因和traf与irf基因也可被oshv-1诱导上调并且在一些时间点与对照形成显著性差异(p<0.05),并且进一步在长牡蛎中建立了以siRNA为介质的RNA干扰技术,在将MAVS干扰后发现CgTRAF2与CgTRAF6、Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF与MAVS抑制表达模式相似,推测CgTRAF2与CgTRAF6、Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF可能位于RLR通路。在MAVS干扰后的攻毒实验结果中,实验组长牡蛎的累积死亡率明显高于正常组和阴性组,说明MAVS在抗OsHV-1的天然免疫中发挥重要作用。这些结果表明长牡蛎中存在MAVS参与的RLR信号通路,并且RLR通路参与OsHV-1的免疫防御作用。综上所述,本研究确定了长牡蛎中存在依赖MyD88的TLR信号通路和MAVS参与的RLR信号通路,并且这两个通路都参与OsHV-1的天然免疫反应,对长牡蛎抗OsHV-1的侵染机制中起着至关重要的作用。