长牡蛎(Crassostrea gigas)TLR和RLR信号通路的免疫功能研究

来源 :中国科学院研究生院(海洋研究所) | 被引量 : 2次 | 上传用户:baimeng1111
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
牡蛎是我国乃至世界重要的海水养殖品种,自1972年在美洲牡蛎中发现了疱疹样病毒,到目前为止,全世界范围内多种双壳贝类中已经检测到牡蛎疱疹病毒-1(Oyster Herpesvirus-1,OsHV-1),并且OsHV-1已被证明与幼虫的大规模死亡有关,在繁育季节幼虫的大规模死亡也为养殖业带来了巨大的经济损失。目前国内外关于牡蛎对OsHV-1的免疫机制的研究还处于一片空白之中,并且对OsHV-1引起的贝类的死亡和病害没有十分有效的解决办法,严重影响了牡蛎养殖业的健康和可持续发展。因此研究牡蛎对OsHV-1的天然免疫反应,从牡蛎机体本身研究其对OsHV-1的免疫防御机制,为预防OsHV-1引起的死亡和病害提供理论基础,也为减少养殖业的的损失提供有力帮助。本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,利用细胞生物学,生物信息学、分子生物学和免疫学等手段,对长牡蛎幼虫和幼贝对OsHV-1的天然免疫反应进行了系统研究,获得的结果如下:TLRs与RLRs是天然免疫防御中重要的模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR),通过RACE技术从长牡蛎中克隆得到了其所属的TLR和RLR信号通路中的关键基因cDNA全长,其中TLR信号通路包括4个TLR基因(分别命名为Cg05421 TLR、Cg17269 TLR、Cg21740 TLR和Cg27513 TLR)和2个接头分子MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88)基因(分别命名为CgMyD88-1和CgMyD88-2),RLR信号通路包括11个RIG-I(Retinoic acid-inducible gene-I)基因(命名为RIG-I-1到RIG-I-11)和一个接头分子MAVS基因(命名为CgMAVS),除此之外还得到了TRAF基因(TNF receptor associated factor)(命名为CgTRAF2和CgTRAF6)和IRF基因(Interferon regutory facror)(命名为Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF)完整的ORF序列。通过SMART结构域分析,发现这些基因大部分具有与脊椎动物同源基因相似的结构域特征,并且氨基酸序列具有一定的相似性,并通过构建进化树分析了这些基因在不同物中的进化地位。通过对长牡蛎生长发育表达谱数据进行cluster分析,挑选表达稳定的cluster中并且与人类管家基因同源的9个基因与长牡蛎中常用的内参基因18srrna(18s),28rrna(28s),elongationfactor-1(ef-1α),β-actin(act)和glyceraldehyde-3phosphate-dehydrogenase(gapdh)共同作为候选内参基因,通过qrt-pcr(quantitativerealtimepcr)技术和genorm软件分析在被oshv-1感染的幼虫样品和未被oshv-1感染的幼虫样品中进行内参基因的筛选,结果表明核糖体蛋白基因rl7与rs18是最适合作为长牡蛎d型幼虫时期和壳顶幼虫时期qrt-pcr的内参基因。在获得最佳内参基因基础上,对4个tlr基因和9个rig-i基因在oshv-1攻毒前后的长牡蛎幼虫样品中,通过qrt-pcr的方法研究其mrna的相对表达量变化,结果表明:3个tlr基因在oshv-1攻毒后壳顶期u2出现峰值,一个tlr基因和9个rig-i基因都在壳顶期u5出现峰值。针对这些结果提出一个假说:三个tlr基因(cg05421tlr、cg17269tlr和cg21740tlr)参与牡蛎幼虫对oshv-1的识别或者介导oshv-1进入牡蛎细胞的细胞膜过程,其蛋白质应该定位在细胞膜上;cg27513tlr基因和rig-i基因参与识别oshv-1进入牡蛎细胞后自身复制产生的中间产物(dna或者rna),其蛋白质定位应该在细胞质内。采用egfp融合蛋白的方法做了4个tlr基因的亚细胞定位实验对这个假说进行验证,结果表明4个tlr基因均定位于细胞质与内涵体中,虽然与假说不符,但是长牡蛎中tlr基因定位于内涵体中发挥作用是国际上的首次报道。另外两个myd88基因cgmyd88-1与cgmyd88-2均定位于细胞质内与其生物学功能相称。为了进一步验证tlr与rlr通路关键基因对oshv-1的免疫防御作用,将含有oshv-1的上清液攻毒长牡蛎幼贝。tlr通路中tlr基因与myd88基因均可被oshv-1诱导上调并且在一些时间点与对照形成显著性差异(p<0.05),并且通过酵母双杂交实验发现cg27513tlr的tir结构域与cgmyd88-2存在蛋白质相互作用,这些结果表明长牡蛎中存在参与oshv-1免疫的依赖myd88的tlr信号通路;rlr通路中rig-i基因与mavs基因和traf与irf基因也可被oshv-1诱导上调并且在一些时间点与对照形成显著性差异(p<0.05),并且进一步在长牡蛎中建立了以siRNA为介质的RNA干扰技术,在将MAVS干扰后发现CgTRAF2与CgTRAF6、Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF与MAVS抑制表达模式相似,推测CgTRAF2与CgTRAF6、Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF可能位于RLR通路。在MAVS干扰后的攻毒实验结果中,实验组长牡蛎的累积死亡率明显高于正常组和阴性组,说明MAVS在抗OsHV-1的天然免疫中发挥重要作用。这些结果表明长牡蛎中存在MAVS参与的RLR信号通路,并且RLR通路参与OsHV-1的免疫防御作用。综上所述,本研究确定了长牡蛎中存在依赖MyD88的TLR信号通路和MAVS参与的RLR信号通路,并且这两个通路都参与OsHV-1的天然免疫反应,对长牡蛎抗OsHV-1的侵染机制中起着至关重要的作用。
其他文献
回 回 产卜爹仇贱回——回 日E回。”。回祖 一回“。回干 肉果幻中 N_。NH lP7-ewwe--一”$ MN。W;- __._——————》 砧叫]们羽 制作:陈恬’#陈川个美食 Back to yield
会议
青虾,学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense),广泛分布于全国各地。2012年青虾养殖年产量约23.7万吨,养殖年产值超150亿元,是我国重要的淡水养殖虾类。青虾雄虾生长速度及
医院文化可以凝聚成一种理想信念,并对医院的发展产生巨大的推动力量。加强医院文化建设对丰富医院文化底蕴及树立良好的医院形象之间相互作用、相互影响。
中国画历史悠久,其表现形式更是魅力无穷。在当今艺术形式多样、表现手法丰富的世界艺术大舞台中,画家不得不思考中国画与广大群众的互动性。好的艺术表现形式需要全世界的响应
<正> 中国革命的偉大勝利,結束了中国人民長期被压迫、被奴役的歷史,中国人民從此成了国家的真正主人?夥帕说闹泄嗣?不僅需要物质生活方面的提高,同時在文化藝術生活方面也
生态护坡是一个复杂的动态系统,目前,对边坡稳定性的研究大多集中在边坡整体稳定性方面,而对生态边坡的浅层稳定性分析较为少见。以张家口地区某公路生态边坡为研究对象,针对
目的探讨异位妊娠失血性休克患者围手术期护理方法。方法对本例异位妊娠出血性休克患者行手术治疗,并给予积极抢救和精心护理。结果患者手术成功,无护理纠纷发生,患者及其家
<正> 蘇聯著名雕塑家們的傑出作品,如穆希娜的‘工人與集體農莊女莊員’、符且提奇為柏林紅軍烈士紀念碑作的‘戰士——解放者’、托姆斯基的‘高爾基像’及‘基洛夫像’、馬
电力自动化系统的构建与完善,对我国电力系统的建设和发展具有重要影响。基于此,介绍电力自动化系统、电子设备以及电力信息技术的特征,分析电子信息技术在电力自动化系统中
回 回 产卜爹仇贱回——回 日E回。”。回祖 一回“。回干 肉果幻中 N_。NH lP7-ewwe--一”$ MN。W;- __._——————》 砧叫]们羽 制作:陈恬’#陈川个美食 Back to yield