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青虾,学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense),广泛分布于全国各地。2012年青虾养殖年产量约23.7万吨,养殖年产值超150亿元,是我国重要的淡水养殖虾类。青虾雄虾生长速度及个体规格显著大于雌虾,收获期雄虾平均规格为雌虾的2～2.5倍；另一方面,青虾秋季养殖过程中会自行繁殖后代(俗称“秋繁”),导致多代同堂,严重影响养殖效益。如果在青虾中实现单性化养殖,既可利用性别差异又可克服“秋繁”现象,将大幅度提高产量、规格和经济效益。迄今有关青虾性别分化规律以及性别决定和性别分化相关基因的研究仍是空白,深入开展此方面的研究可为发展性别控制技术实现单性化养殖提供指导,在理论和生产上均具有重要意义。本文以青虾为研究对象,通过组织切片法确定青虾性别分化的规律、关键时期以及与个体大小和日龄的关系；从本实验室构建的精巢均一化全长cDNA文库表达序列标签(express sequence target, EST)中,筛选出12个性别相关的侯选基因；以EST为基础,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了4个与性别决定相关基因(transformer 2, sex lethal 1、sex lethal 2 及 male-special lethal 3)和1个性别发育相关基因(extra sex combs)的全长cDNA,并对其序列特征和时空表达模式进行了分析；同时初步建立了青虾RNA干扰技术。本文研究有助于阐明青虾性别决定和性别分化的分子机制,并可为青虾性别控制技术研究提供指导。1、青虾性别分化及其与个体大小和日龄的关系本研究设计快速生长群体和慢速生长群体,通过组织切片法对青虾性腺发生、性别分化过程及其组织学特征进行了观察。经过对192尾同龄不同大小的变态后仔虾组织切片的系统比较分析,确定青虾性腺分化主要是由变态后仔虾日龄决定,而非个体大小决定,并且卵巢分化早于精巢。水温控制在28℃左右,在变态后第9日龄,体长6.23-7.74 mm开始分化出性腺原基；变态后第11日龄,体长7.09～9.74 mm出现原始生殖细胞；第15日龄体长8.21～12.3 mm出现生殖细胞,此时原始性腺基本形成。变态后第18日龄,体长8.9～13.96 mm卵巢开始分化；变态后第20日龄体长10.7～13.1 mm卵巢内出现了卵原细胞,变态后第30日龄体长18.2～25.7 mm卵巢分化完成,出现了卵母细胞。精巢在变态后第20日龄(体长11.7～14.95mm)开始分化,变态后第23日龄(体长12.4～19.8 mm)精巢腔逐渐形成,变态后第25日龄(体长17.6～22.6 mm)出现了精原细胞和生精小管,变态后第30日龄(体长18.2～31.5 mm)精巢分化完成,性腺肉眼可明显区分出精巢或卵巢。本研究为后续性别决定和性别分化相关基因生物功能分析及性别控制技术研究提供了理论基础。2、青虾性别决定相关基因的筛选、克隆及时空表达分析从本实验室构建的精巢均一化全长cDNA文库的ESTs中,通过GO分类和已有相关文献资料进行序列比对分析,共筛选出12个与性别决定及性别发育有关的基因。经预备扩增试验及序列比对,进一步筛选出transformer 2 (Mntra-2)、sex lethal (Mnsxl). male-special lethal 3 (Mnmsl 3)等4个性别决定相关基因。以其EST为基础,采用RACE技术成功克隆了青虾Mntra-2、Mnsxls及Mnmsl 3基因的全长cDNA序列。从青虾精巢中克隆得到的性别相关基因Mntra-2和Mnms13cDNA序列全长分别为1724和1378bp,开放阅读框分别为579和1092 bp,编码192和363个氨基酸的蛋白。其中青虾Sxl基因的RNA存在选择性剪接,获得Mnsxl 1 和 Mnsxl 2两种转录本,其全长cDNA序列分别为1138 bp和1214 bp, ORF分别编码308和241个氨基酸,前者比后者在C端多了67个氨基酸。Mnsxl 1 和 Mnsxl2推导的氨基酸序列与昆虫的Sx1基因高度相似,并且包含有2^ RNA-binding motifs。推导的Mnmsl 3蛋白N-端具有一个克罗莫结构域(CBD),C-端有一个MRG结构域。系统发育树分析表明这四个基因与膜翅目和鳞翅目昆虫有较近的亲缘关系。生物信息学分析发现这几种蛋白均含有酰胺化位点、蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和N-豆寇酰化位点等多个修饰位点。青虾胚胎、幼体和仔虾各发育时期以及成体组织qRT-PCR研究结果表明,Mntra-2、Mnsxl 1、Mnsxl2以及Mnmsl 3在成体青虾组织中广泛分布,其均表现出精卵巢表达差异,但均非性腺中表达量最高。其中Mntra-2在肠和肌肉中高丰度表达,Mnsxl 1和Mnsxl 2分别在肠和肝脏中表达量最高,而Mnmsl 3则表现出在精巢和脑中高表达的特征。它们在胚胎发育以及变态后的仔虾性别分化过程中的表达模式基本相似,均表现为在青虾胚胎发育过程中的无节幼体期以及在变态后第1-5日龄和第15～20日龄的仔虾中(也就是性腺分化关键时期)表达量急剧上升,推测它们可能在青虾外部性特征形成以及内部性腺组织分化过程中发挥重要作用。利用PCR技术扩增获得青虾的Tra-2基因(Mntra-2)的基因组序列,Mntra-2的DNA序列包括5个外显子和4个内含子,通过与已经获得的Mntra-2的cDNA进行比对分析,发现第1外显子、第2外显子的一部分和第5外显子的一部分是非编码区。经过对内含子序列分析发现,两种基因的所有的内含子两侧具有5’GT和3’AG的二核苷酸结构,即都属于GT-AG内含子。3、青虾性别发育基因extra sex combs (Esc)的克隆、表达及RNA干扰(RNAi)研究以青虾精巢cDNA文库EST序列为基础,采用RACE技术首次克隆获得青虾extrasex combs基因(Mnesc)。该基因全长cDNA序列为1461 bp, ORF 1068 bp编码355个氨基酸。生物信息学分析发现此预测蛋白具有5个WD重复保守结构域,其N-末端区域包含一个潜在的核定位信号,具有蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、酰胺化位点以及N-糖基化位点等修饰。qRT-PCR研究结果表明,Mnesc基因在卵巢和脑中表达量最高,但在精巢中的表达却极其微弱,推测Mnesc基因可能与卵母细胞成熟有关,其生物学功能可能由中枢神经系统所控制。而发育过程表达分析显示其主要在早期胚胎的囊胚期以及孵化后第4日龄(第Ⅲ)幼体时期表达量最高,推测Mnesc可能是母本效应基因,且与青虾早期幼体体节分化有关。另外,本研究通过体外转录技术合成Mnesc双链RNA (double strained RNA, dsRNA),并将其从心脏注射青虾体内干扰目标基因的表达。结果显示,在心脏注射Mnesc-dsRNA4天和1周后发现脑和卵巢组织中的Mnesc mRNA表达量均被有效降低,本研究为后续青虾基因功能和基因表达调控研究提供了新的途径。