【摘 要】
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淀粉蔗糖酶（Amylosucrase）是一种新型葡萄糖基转移酶,属于糖苷水解酶家族13,是该家族中唯一一种具有聚合作用的酶。该酶催化蔗糖的水解反应不需要ADP或UDP等昂贵物质作为前体,而只需要廉价的蔗糖在糖苷键裂解时释放的能量,根据受体的不同可以合成淀粉、葡聚糖、寡糖和复合糖等。该酶的发现实现了人为的合成有目的的多糖、增加淀粉分子聚合度和分子量。为治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒类的多糖类药物的制
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淀粉蔗糖酶（Amylosucrase）是一种新型葡萄糖基转移酶,属于糖苷水解酶家族13,是该家族中唯一一种具有聚合作用的酶。该酶催化蔗糖的水解反应不需要ADP或UDP等昂贵物质作为前体,而只需要廉价的蔗糖在糖苷键裂解时释放的能量,根据受体的不同可以合成淀粉、葡聚糖、寡糖和复合糖等。该酶的发现实现了人为的合成有目的的多糖、增加淀粉分子聚合度和分子量。为治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒类的多糖类药物的制备提供基础,并为增加淀粉分子链长和分子聚合度进而改变淀粉应用性质和品质,提供可实现的途径。因此,淀粉蔗糖酶将成为工业上合成多糖类聚合物的一种简单、方便、有效的葡萄糖基转移工具,具有广阔的发展空间。本研究根据奈瑟氏球菌中的淀粉蔗糖酶基因的保守序列设计引物,通过TD-PCR扩增方法克隆出多糖奈瑟球菌（ATCC43768）基因组中编码淀粉蔗糖酶的基因AS,将其与pMD-18T载体连接,得到重组质粒T-AS。将该基因插入表达质粒pET-28a中,构建重组质粒pET-AS,在E.coli.BL21中经IPTG进行诱导表达。通过响应面法对重组菌发酵工艺条件进行优化,提高淀粉蔗糖酶的酶活力。结果如下：1.利用梯度PCR技术从多糖奈瑟菌ATCC43768染色体基因组中扩增出淀粉蔗糖酶基因（AS）,克隆到载体pMD-18T后进行测序,结果表明：克隆得到的AS基因序列与多糖奈瑟球菌ATCC85322菌株同源性达96%,对应的氨基酸同源性为97%。ATCC43768的AS基因与Neisseria mucosa C102（86%）、Neisseria macacae（86%）、Neisseria sp （85%）的淀粉蔗糖酶基因均有一定的同源性。2.构建重组表达质粒pET-AS,将重组质粒转化到表达宿主菌E.coli.BL21（DE3）中,用诱导剂IPTG诱导重组菌淀粉蔗糖酶基因进行过量表达。通过对诱导时间,诱导剂浓度进行初步优化,确定了诱导表达的最佳条件因素为IPTG终浓度0.6mmol/L,诱导时间为5h。3.对重组菌的发酵条件进行单因素实验,确立了影响重组菌生长及酶表达的最佳单因素,分别为发酵温度35℃,发酵液初始pH6.5,接种量2%,摇床转速180rpm。在单因素实验的基础上,利用响应面分析法对淀粉蔗糖酶基因工程菌发酵工艺进行优化,发酵最佳工艺为：发酵温度35℃,发酵液初始pH6.5,接种量1.9%,摇床转速190rpm。酶活达到最大值39.4U/mL,酶活比多糖奈瑟球菌原菌提高了21.9倍。
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