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研究背景随着喉部微创技术在我国的不断发展,经口CO2激光、低温等离子显微内镜手术治疗喉部疾病的适应症不断扩大,手术患者的需求量逐渐增加。虽然该手术技术具有创伤小、恢复快、疗效佳、喉功能保全相对良好等优势,同时新的手术模式也带来新的临床问题。针对喉部疾病,尤其是双侧声带病变且累及前联合,如喉乳头状瘤、双侧声带白斑、早期声门型喉癌等,即使术中谨慎操作,术后仍有发生声带粘连的风险,发生风险程度与手术深度和范围有密切联系,因此声带癌术后的创面管理尤为引起重视。轻者临床表现为发声障碍,严重者呼吸困难。目前报道治疗和预防双侧声带及前联合粘连或喉蹼的方法大致分为4类:喉裂开切除喉蹼放置支架,由于需气管切开,颈前皮肤留有瘢痕,创伤大且影响美观,已基本不再使用;黏膜瓣修复,对手术者操作要求高,应用范围同样受到限制;显微喉镜手术切除粘连或喉蹼,放置喉膜,该技术应用较广,疗效较为肯定;局部涂抹药物,包括透明质酸、丝裂霉素等,目前部分研究认为药物涂抹实用方便,可以作为喉膜植入后的辅助手段,但不存在公认的疗效确切的预防声带粘连药物,证据仅限于动物实验和小规模的临床试验。因此,我们认为寻找一种能抑制瘢痕生长的疗效肯定的药物是亟待解决的问题。研究目的探索顺铂对人原代声带成纤维细胞的抗增殖和抗纤维化作用。研究方法1、取喉狭窄患者术后的瘢痕组织,利用体外组织块培养技术从中分离声带成纤维细胞（HVFFs）,并用形态学和免疫细胞化学方法共同鉴定;2、通过不同浓度的顺铂对鉴定后的HVFFs进行体外处理,在不同时间点采用CCK-8法检测HVFFs的相对生存率;3、利用转化生长因子（TGF-β1）诱导HVFFs的肌成纤维细胞表型,再用顺铂进行处理,通过细胞免疫荧光对顺铂处理前后α-SMA表达量进行检测;4、通过不同浓度的顺铂对HVFFs进行体外处理,利用实时定量荧光PCR和蛋白免疫印迹试验检测不同时间点胶原蛋白III型和胶原蛋白I型m RNA水平的表达量;5、通过顺铂对HVFFs进行体外处理,利用蛋白免疫印迹检试验测纤维化相关蛋白Smad2、p-Smad2、Smad-3、p-Smad3和凋亡相关蛋白caspase-3在不同时间的表达量。研究结果1、体外成功分离、培养、传代HVFFs,细胞传至8代左右,活力逐渐下降,2-7代细胞活性较优,用于后续细胞实验,免疫荧光结果显示Vimentin阳性,结合镜下形态学观察鉴定HVFFs;2、CCK-8结果显示,顺铂呈剂量和时间依赖性降低HVFFs的相对生存率,免疫蛋白印迹结果表明HVFFs中凋亡相关蛋白caspase-3表达水平上调,以上结果证实了顺铂的抗增殖作用;3、顺铂处理后逆转了HVFFs的激活分化,同时减少了TGF-β1诱导上调的α-SMA染色强度,实时定量荧光PCR结果显示,顺铂处理后的HVFFs中胶原蛋白III型和胶原蛋白I型的表达下调。顺铂可下调由TGF-β1诱导上调的纤维化相关蛋白表达量,且后期检测到胶原蛋白III型、胶原蛋白I型、Smad2、p-Smad2、Smad-3、p-Smad3表达水平较前期更低,以上结果证实了顺铂抗纤维化的作用。研究结论顺铂能诱导体外HVFFs的抗增殖和抗纤维化改变。因此,该研究提示顺铂对于减轻CO2激光显微外科术后因伤口延迟愈合引起的声带瘢痕增生和喉狭窄是一种潜在有效的药物。