寻找可持续和可再生能源需要共同努力,以满足未来的能源需求并减少气候变化的有害影响。在这方面,生物质能源,如木质纤维素作为一种有效的能源在近几十年被广泛讨论。利用木质纤维素生物质的主要瓶颈是将来源于不同的生物质水解成可发酵的糖。利用生物方法水解木质纤维素生物质已经成为一种环保、可持续和可再生的方法,特别是超耐热微生物对于木质纤维素生物质的转化具有独特的潜力,因为它们可以在高温环境下生存,并且通常能够耐受极端的工业条件。超嗜热热袍菌属的微生物可以在90℃环境中生长,并可以产生一系列的水解酶来降解碳水化合物聚合物,这使得它们成为高效生物质降解的优秀候选者,同时也是多种嗜热酶的重要来源。为了扩大高温酶的大规模工业应用,人们采用了多种策略来提高其产量和热稳定性,包括优化生长条件、基因和化学修饰以及开发高效的表达调控系统等。此外,木质纤维素生物质的高效转化需要纤维素酶和半纤维素酶（甘露聚糖酶和木聚糖酶）的协同作用。在此之前,由于预处理方法去除了生物质的半纤维素部分,因此半纤维素酶特别是甘露聚糖酶并没有受到太多的关注。然而,随着绿色预处理方法的发展,半纤维素部分保持完整,半纤维素酶的开发已成为高效利用木质纤维素生物质的重要一环。本研究中,来源于海栖热袍菌（Thermotoga maritima）的TM1752基因在大肠杆菌中利用热激表达载体“pHsh”获得高效表达,且该基因的功能曾被注释为纤维素酶Cel5B。通过对重组蛋白进行了纯化并进行了酶学性质鉴定。令人惊讶的是,纯化的酶对底物半乳甘露聚糖和羧甲基纤维素的比活性分别为416U/mg和215U/mg,且甘露聚糖酶活性在嗜热酶中最高。但是,该酶与之前报道的任何甘露聚糖酶相比,其序列一致性较低。因此,该酶被鉴定为双功能甘露聚糖酶和纤维素酶,并更名为Man/Cel5B。有趣的是,Co2+使Man/Cel5B的酶活性最高提高到200%,因此,在1mM Co2+离子存在的情况下,酶学特性进一步获得解析。Man/Cel5B在85℃和pH 5.5时活性最高。85℃孵育5 h后活性保持在50%以上,pH值5-8孵育1h后活性保持在80%以上,因此具有较高的热稳定性和pH稳定性。且对半乳甘露聚糖的Km和Vmax分别为4.5 mg/mL和769 U/mg。通过薄层色谱分析表明,Man/Cel5B可以有效地将刺槐豆胶降解为甘露二糖、甘露三糖和甘露寡糖。此外,用Man/Cel5B降解木屑12h后可产生80μM的还原糖。所有这些特征表明,Man/Cel5B在未来的食品、饲料和生物燃料工业中具有广泛的应用前景。为了在生产成本上与化石燃料竞争,应尽一切努力使生物质降解酶更有效和更经济可行。除了酶蛋白的稳定性较低、生产成本较高之外,生产可溶性酶的主要问题之一是从催化过程完成后的反应混合物中回收它们,这个过程非常昂贵。在固体基质上/内部的固定化酶是一种有效的技术来抵消这些限制。在这方面,用戊二醛活化壳聚糖珠固定化Man/Cel5B,载蛋白质率和固定化收率分别达到了 73.3%和71.8%。傅里叶红外光谱证实了Man/Cel5B固定在壳聚糖珠上。对固定化的Man/Cel5B进行了生化表征,并与不添加Co2+离子的可溶性Man/Cel5B进行了性能比较。固定化Man/Cel5B的最佳温度从85℃提高到95℃,但最适pH值保持不变。此外,对游离和固定化的Man/Cel5B水解刺槐豆胶的热力学进行了评价。结果表明,固定化酶的活化能降低。此外,固定化酶的热稳定性也有很大程度的提高,在85℃下孵育5h,酶活性保留率为65%,而游离酶的活性保留率为55%。且在较高的温度下,游离酶比固定化酶失去活性更快。固定化酶在90℃和95℃孵育5h后活性分别保持60%和50%以上。而在90℃和95℃条件下,5h后游离酶活性仅为初始酶活性的49%和26%。固定化酶可重复使用15次,活性保留达54%。超嗜热热袍菌是生物质降解和生产超耐热酶的重要优势菌种。为了充分开发该微生物菌群的生物技术潜力,对其进行遗传操作是一种可取的方法。在本论文的最后部分,建立了一套基因敲除系统,利用同源重组实现了热袍菌glms基因的缺失。首先构建了一种含有氯霉素耐药基因和glms基因上下行同源重组区域的自杀载体“pTs2”质粒,该质粒缺乏超嗜热菌的复制起始点。将质粒用超声波的方法转化到那不勒斯热袍菌（T.neapolitana）中。采用不同的时间间隔进行试验,发现40秒（40 kHz）的超声波处理是将DNA转化到那不勒斯热袍菌中的最佳时间。在抗生素选择压力条件下,通过单插入,发现质粒整合在了T.neapolitana基因组glms基因下游。在葡萄糖胺存在和不存在两个条件下培养产生的突变体,选择进行了外源质粒融合的双交换菌落,使的原始质粒骨架和glms基因一起丢失。第二个杂交突变体只能在葡萄糖胺存在的情况下生长。本研究开发的基因敲除系统将从系统的、遗传的角度为阐明那不勒斯热袍菌未知基因功能开辟一条道路。该体系也可用于基因敲入,构建高效生物质降解的超嗜热热袍菌株。最后,从海栖热袍菌（Thermotoga maritima）中分离得到一种新型双功能甘露聚糖酶和纤维素酶,能有效地将刺槐豆胶降解为甘露二糖、甘露三糖和高级甘露寡糖。此外,该酶还能将各种农业废弃物降解为可发酵糖。因此,该酶在生物燃料和食品工业中具有巨大的应用潜力。该酶的固定化可以提高酶的热稳定性,并可重复利用,提高了酶的生物技术应用。建立了敲除热袍菌（Thermotoga neapolitana）glms基因的两步同源重组方法。该方法可用于热袍菌的遗传操作,为进一步提高该菌属的生物质降解性能奠定基础。此外,该方法还可用于敲入Man/Cel5B的编码基因TM1752,以强化热袍菌属的生物质降解能力.