研究背景和目的据美国癌症协会的统计资料显示,2012年新预测的癌症发病率以及死亡率,结直肠癌依然稳居第三位,约占总数的9%；在男性中发病率仅次于前列腺癌和肺、支气管肿瘤,而在女性仅次于乳腺癌和肺、支气管肿瘤。在我国随着生活水平的提高、饮食结构的改变,结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势。转移是结直肠癌患者死亡的最主要原因。MicroRNA(miRNA)是一类大小约为19-25个核苷酸的小分子RNA,普遍存在于真核生物和原核生物中,与细胞分化、细胞周期和凋亡相关。MicroRNA通过miRISC(miRNA-associated, multiprotein RNA-induced silencing complex)与靶mRNA的3’UTR结合,从而促进靶mRNA降解或者抑制其翻译。最近研究表明, microRNA在多种肿瘤发生过程中发挥重要作用,包括白血病、肺癌、乳腺癌和结直肠癌。MicroRNA通过调控癌基因或抑癌基因的表达,或者自身发挥促癌或抑癌作用,从而参与结直肠癌的发生过程。据推测特定microRNA的表达水平可能有助于肿瘤诊断、预后评估,microRNA可能成为肿瘤治疗新的分子靶标。2008年Tavazoie SF等学者发表在《Nature》上的文章最早报道：内源性miR-335抑制乳腺癌的转移,其主要通过负向调控转移相关基因SOX4、TNC抑制乳腺癌转移。研究显示miR-335在乳腺癌、卵巢癌均表达缺失或减低。除此之外,文献报道：miR-335调节间充质干细胞的增殖、迁移和分化,过表达miR-335其增殖、迁移受到抑制；过表达miR-335通过调节Bcl-w和SP1抑制胃癌的侵袭和转移。miR-335在结直肠癌发生发展中的作用和机制目前尚未见报道,因此本文的研究目的是明确miR-335在结直肠癌中的表达特性,探讨miR-335作用的分子机制,对miR-335在结直肠癌中的功能进行初步的研究。研究方法1.miR-335在不同转移潜能结直肠癌细胞系中的表达采用荧光定量RT-PCR的方法检测了SW480、SW620、HT29、LOVO、HCT116、 Caco2、LS174T、DLD1等8种结直肠癌细胞中miR-335的表达。2.miR-335靶基因的预测及验证(1)利用生物信息学在线网站TargetScan、Pictar和microRNA.ORG预测miR-335的靶基因,筛选miR-335的候选靶基因；(2)利用荧光定量Q-PCR检测miR-335及其靶基因在4种不同结直肠癌细胞株中的表达,并进行相关性分析；(3)扩增包含RASA13’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut载体。利用荧光素酶报告系统检测RASA1与miR-335的结合情况,确定RASA1是否为miR-335直接作用的靶基因。3.miR-335过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响(1)扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至pLVTHM慢病毒载体(2)慢病毒包装,以及miR-335过表达结直肠癌细胞株的筛选和鉴定。(3)利用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成实验和Transwell细胞迁移实验、划痕实验检测miR-335过表达对SW620、HCT116、HT29细胞增殖、侵袭能力的影响。4.结直肠癌中miR-335作用分子机制的初步研究利用Western Blot检测过表达miR-335的细胞SW620、HCT116中靶基因RASA1,以及p-RASA1、Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白质的表达。5.统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。荧光定量PCR结果比较2--Ct值、Transwell迁移实验、平板克隆形成实验均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时采用Welch近似方差分析：方差齐性的多重比较采用LSD法、SNK(Student-Newman-Keuls)法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法。相关性分析,双变量服从正态分布时用Pearson相关分析,不服从时采用Spearman相关分析。荧光素酶活性检测结果方差齐性时采用两独立样本t检验(Independent-Samples T text),方差不齐时采用近似t检验。CCK8体外增殖实验采用析因设计的方差分析和单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.miR-335在不同转移潜能结直肠癌细胞系中的表达荧光定量PCR结果显示,以SW480细胞为参照,8种细胞之间miR-335的表达差异有统计学意义(F=109.947, P<0.001)。经Dunnett’s T3多重比较发现,除SW480外miR-335在HCT116细胞中的表达高于其他6种细胞(P值分别为0.028,0.006,0.023,0.007,0.012,0.008); miR-335在LOVO中的表达低于HT29(P=0.002)。2.miR-335靶基因的生物信息学分析及荧光素酶实验分析(1)应用生物信息学预测软件TargetScan、PicTar、MICRORNA.ORG对miR-335的靶基因进行预测,3个网站的交集共得到100多个基因,其中包括在肿瘤的发生发展及转移过程中发挥重要作用的基因,如：JAG1、MLLT3、JMJD2C、 CD79B、WWP1、RASA1、SP1、SNIP1、MAX等。(2)通过查阅文献,初步候选WWP1、SNIP1、RASA1作为miR-335的靶基因进行研究。荧光定量PCR检测4种细胞株SW480、SW620、HT29、HCT116中WWP1、 SNIP1、RASA1和miR-335的表达水平。4株细胞间miR-335和RASA1的表达差异均具有统计学意义(F=11.934, P=0.003; F=489.764, P<0.001), Spearman相关性分析,结果显示miR-335和RASA1二者存在显著的负相关关系(r=-0.797,P=0.002)。(3)构建psiCHECK-2/RASA1-3’UTR载体及其突变载体。psiCHECK-2/WT-3’UTR和miR-335mimics、NC共转染后,293A细胞和SW480细胞荧光素酶活性分别降低21.01%和29.68%；经统计分析,差异均有统计学意义(P=0.001、P=0.023)。突变质粒psiCHECK-2/MUT-3’UTR与miR-335mimics、NC共转染均不能改变荧光素酶活性(P=0.379、P=0.953),表明miR-335与RASA13’UTR可发生特异性结合。3.miR-335过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响(1)慢病毒表达载体pLVTHM/miR-335的构建(2)筛选建立稳定过表达miR-335的细胞株SW620、HCT116、HT29(3)荧光定量PCR鉴定miR-335及其靶基因RASA1的表达SW620、HCT116、HT29细胞3组间mir-335的表达差异均有统计学意义(F=33.146, P=0.012; F=2817.652, P<0.001; F=23.335, P=0.013)；两两比较发现,SW620细胞中mir-335的表达在mir-335转染组高于空白组和pLVTHM对照组(P=0.046, P=0.046); HCT116细胞株(P<0.001, P<0.001)、HT29细胞株(P=0.039,P=0.038)中得到相同的结果；说明mir-335转染成功。SW620和HCT116细胞3组间RASA1的表达差异均有统计学意义(F=28.362, P=0.001; F=12.251, P=0.008);HT29细胞3组间RASA1的表达无明显差异(F=0.818, P=0.485)。两两比较分析后发现,SW620细胞中RASA1的表达在mir-335转染组低于pLVTHM对照组(P=0.002); HCT116细胞中mir-335转染组高于pLVTHM对照组(P=0.003)。说明SW620细胞中过表达mir-335后抑制其靶基因LASA1mRNA的表达。(4)体外功能实验a.CCK8细胞增殖实验SW620、HCT116和HT29细胞中3个组的生长时间水平差异均具有统计学意义(F=967.049, P<0.001; F=1734.503, P<0.001; F=307.456, P<0.001); SW620和HT29细胞组间增殖能力差异有统计学意义(F=274.497,P<0.001；F=57.425,P<0.001),HCT116细胞组间增殖能力差异无统计学意义(F=2.098,P=0.138); SW620和HT29细胞时间与细胞组间交互效应差异有统计学意义(F=48.225,P<0.001; F=4.736, P<0.001), HCT116细胞交互效应差异无统计学意义(F=1.248,P=0.295)。SW620、HT29细胞除第1天(P=0.182, P=0.230)外,各时间3组细胞间差异具有统计学意义(均为P<0.05)；HCT116细胞各时间3组细胞间均无明显差异(均为P>0.05)。以上结果说明,过表达mir-335促进SW620细胞体外增殖；对HCT116细胞体外增殖能力无影响；HT29细胞pLVTHM组和mir-335过表达组之间细胞增殖无明显差异。b.平板克隆形成实验SW620细胞空白对照组、pLVTHM组和miR-335过表达组的克隆形成率分别为18.833%.19.667%.34.000%, HCT116细胞38.667%,51.000%.49.000%, HT29细胞9.000%、8.667%、6.667%。SW620和HCT116细胞株中3组细胞间的克隆形成能力具有显著差异(F=69.478, P<0.001; F=6.760, P=0.029);HT29细胞株中3组细胞间克隆形成能力的差异没有统计学意义(F=1.049,P=0.407)。两两比较后结果显示,在SW620细胞株中,miR-335转染组细胞的克隆形成能力高于空白组、pLVTHM组(P<0.001, P<0.001); HCT116细胞株中miR-335转染组与pLVTHM组克隆形成率差异无统计学意义(P=0.599)。c. Transwe11小室细胞运动实验SW620、HCT116、HT29三组细胞间迁移能力均具有显著差异(F=10.957,P=0.006；F=157.249,P<0.001；F=56.344,P<0.001)。两两比较结果显示：SW620细胞株中miR-335组穿膜细胞数多于空白组和pLVTHM组(P=0.020, P=0.012),HCT116细胞(P=0.004, P<0.001)、HT29细胞(P<0.001,P<0.001)亦得到相同的结论。上述实验结果表明过表达miR-335促进结直肠癌细胞SW620、HCT116和HT29的迁移能力。d.划痕实验检测细胞迁移能力SW620细胞中miR-335组划痕后120h、HT29细胞中96h,细胞已基本完全覆盖划痕区域,而空白组和pLVTHM组则未完全覆盖。HCT116细胞中,划痕后96h,miR-335组划痕间距与空白组近似,但是明显窄于pLVTHM组。上述实验结果表明,与pLVTHM组相比,过表达miR-335后结直肠癌细胞SW620、HCT116和HT29的迁移能力增强。4.结直肠癌中miR-335作用分子机制的初步研究miR-335过表达细胞株SW620、HCT116中靶基因RASA1蛋白质水平均下降。与对照组相比过表达miR-335后,SW620细胞中,p-RASA1、Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白质表达均上调。HCT116细胞中,Ras蛋白质稍下降,而ERK1/2、p-ERKl/2蛋白质水平无明显变化。结论：1.我们初步证实在结直肠癌细胞中RASAl是miR-335直接作用的靶基因。2.过表达miR-335促进结直肠癌SW620细胞增殖、克隆形成、迁移能力；促进HT29、HCT116迁移能力；而对HT29、HCT116增殖和克隆形成无影响。3.通过Western Blot进一步证实过表达miR-335通过抑制RASA1而激活Ras/MAPK信号通路,使Ras、ERK1/2、p-ERK1/2表达上调,从而促进结直肠癌细胞增殖。本研究的创新之处：1.在结直肠癌细胞中RASA1是miR-335直接作用的靶基因；2.过表达miR-335通过抑制RASA1而激活Ras/MAPK信号通路促进结直肠癌细胞增殖。