第一章摘要：端粒酶介导的人类胚胎干细胞(HESCs)端粒延长目的：端粒结构和长度的维持是细胞进行持续增殖的必要条件之一。人类胚胎干细胞来自于囊胚内细胞团,具有各个胚层的分化潜能,并在体外建系的过程中获得了自我更新能力,具有高活性的端粒酶是其重要的特征之一。在分化过程中,胚胎干细胞失去端粒酶活性并且端粒长度逐渐缩短,提示了端粒维持与自我更新特性的联系。目前,人类胚胎干细胞中端粒的维持状态还未见深入的研究报导。本研究通过对人类干细胞国家工程研究中心的胚胎干细胞库中大量样本进行端粒维持的状态分析来探讨人类胚胎干细胞端粒维持的方式,机制及意义,并且希望通过研究端粒维持的特征寻找人类胚胎干细胞新的潜在标记物。材料：在签署知情同意书并经中信湘雅生殖与遗传医院伦理委员会通过后,体外受精实验室不实行胚胎移植的胚胎被收集,并与建系早期人类胚胎干细胞(传代周期≤15代)以及建系后体外培养长达两年的人类胚胎干细胞端粒维持情况进行比较。人类胚胎干细胞库中多达96株胚胎干细胞,胚胎干细胞来源的畸胎瘤以及在体外染色体发生变异的胚胎干细胞的端粒长度也在本研究中进行了统计分析。方法：1,采用定量染色体原位杂交技术以及端粒限制性片段长度分析来对囊胚和人类胚胎干细胞端粒长度进行检测。2,采用端粒重复片段扩增(TRAP)实验和实时定量PCR技术对端粒酶的活性和表达量进行分析。3,采用免疫荧光和DNA杂交相结合的技术检测ALT-associated promyelocytic leukemia nuclear bodies (APBs),以及端粒姐妹染色体交换实验对端粒维持旁路途经进行检测。4,采用慢病毒介导的shRNA(shTERT)对人类胚胎干细胞进行干扰,用以评估端粒酶在干细胞培养过程中的功能。5,采用端粒异染色质标记物H3K9me3和H4K20me3分别与端粒结合蛋白TRF1的免疫荧光共定位,以及染色质免疫共沉淀对端粒染色质的组蛋白甲基化进行分析。6,通过常规的染色,体外形成拟胚体,体内形成畸胎瘤实验对不同时期人类胚胎干细胞多能性及多向分化能力进行分析。结果：1,人类胚胎干细胞在培养早期逐渐获得相对于囊胚期更长的端粒,这一过程在体外培养第十五代左右达到稳定并持续高达95个传代周期。2,进一步追踪人类胚胎内细胞团和建系早期的胚胎干细胞发现,囊胚内细胞团具有高活性的端粒酶,并且在胚胎干细胞的培养过程中持续高表达；通过慢病毒介导的shRNA方法干扰细胞端粒酶核心组分表达后,能够有效地抑制端粒增长的速度；在早期和晚期的胚胎干细胞中,端粒重组途径都受到抑制,这些现象说明端粒的延长过程主要依赖于端粒酶的活性。3,在人类胚胎干细胞中,β-catenin与端粒酶启动子转录起始区域直接结合,刺激WNT-β-catenin信号通路能够有效的提高端粒酶的表达水平,提示端粒酶的表达受WNT-β-catenin信号通路调控。4,端粒区域的DNA异染色质标记,组蛋白H3K9me3和H4K20me3的甲基化程度伴随着端粒延长逐渐降低,在大于十五代培养后趋向稳定,与端粒长度稳定时问一致。因此,端粒表观遗传学的改变可能通过影响端粒酶与端粒DNA结合参与调控端粒长度。5,在目前的多能性检测指标下,不同培养代数的人类胚胎干细胞并无显著差异。6,干细胞库中96株人类胚胎干细胞的端粒调查结果显示,端粒长度趋向集中,平均为12.02±1.01kb。而以往报道的发生染色体变异的人类胚胎干细胞端粒长度与这一数据有着显著差异(P<0.05),同时,胚胎干细胞体内成瘤后也出现端粒的显著(P<0.05)延长。结论：本研究显示在体外培养早期端粒延长存在于人类胚胎干细胞体外建系并获得自我更新能力的过程并依赖于受Wnt-β-catenin信号调控的端粒酶活性,并提示端粒区域表观遗传学的改变影响了端粒酶进入功能区域发挥作用,可能是端粒长度在长期培养后趋向稳定的重要因素。对于本库中96株体外稳定培养的,符合人类胚胎干细胞常规指标的细胞系端粒长度的统计结果显示,端粒长度分布集中,在染色体变异和形成畸胎瘤的情况下发生明显变化,提示其长度和稳定性可作为鉴定人类胚胎干细胞或者人类胚胎干细胞来源分化细胞安全性的潜在新指标。第二章摘要：HER2转基因小鼠的病理改变研究目的：ERBB2/HER2/NEU,是上皮生长因子(EGFR)受体家族中的成员之一,在25%的非小细胞肺癌病人中过表达,被认为是显著的独立的肺癌预后指标。但是其参与肺癌发生的过程及机制还没有在动物模型上得到细致的研究。在本研究中,希望通过转基因动物模型对这一基因如何参与肺癌的发生发展进行探讨。材料：过表达HER2的转基因小鼠模型通过人类的表皮分泌蛋白C(human surfactant protein-C)启动子调控,特异的在远端呼吸道上皮表达HER2基因。阳性建系小鼠与母代种系小鼠C57回交后得到的阳性F1代用于实验观察,同窝阴性小鼠设为对照。方法：不同月龄的小鼠取肺组织进行病理切片分析表型；免疫组化染色检测原癌基因的表达以及炎症相关因子(TNF-alpha,IL-1,IL-6)的检测；实时定量PCR技术检测肺组织内基因的表达。结果：对于转基因小鼠的长期病理追踪发现,在阳性的4到8月龄F1代HER2转基因小鼠的肺组织中出现了明显的炎性病理改变,包括淋巴细胞浸润,间质细胞增生等,更为年长的小鼠(12到18月龄)肺部甚至出现类似于人类的癌前病变。经过统计发现,病变的程度和机率与鼠龄呈正相关。进一步检测与炎症相关的肿瘤坏死因子(TNF-alpha),白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)发现,随着鼠龄增长,这些因子在肺部表达也出现增加。结论：本研究结果提示长期培养的HER2过表达小鼠会导致严重的肺部炎症,这一炎症的发展有可能是导致癌前病变的原因。这一模型对于研究HER2在肺癌发生过程中所起的作用以及探讨炎症与癌症的关系将起到帮助。