【摘 要】
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第一部分 高糖、高脂对Clpp和线粒体动力学的影响目的:探讨高糖、高脂对Clpp和线粒体动力学的影响。方法:小鼠胰岛β细胞Min6细胞分别用不同浓度葡萄糖（5.6mmol/l、16.7mmol/l和33.3mmol/l）和不同浓度棕榈酸（0.2mmol/l、0.5mmol/l和1.0mmol/l）的培养基,分别处理不同时间（24小时、36小时和48小时）,观察CLPP的mRNA和蛋白质表达水平的变
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第一部分 高糖、高脂对Clpp和线粒体动力学的影响目的:探讨高糖、高脂对Clpp和线粒体动力学的影响。方法:小鼠胰岛β细胞Min6细胞分别用不同浓度葡萄糖（5.6mmol/l、16.7mmol/l和33.3mmol/l）和不同浓度棕榈酸（0.2mmol/l、0.5mmol/l和1.0mmol/l）的培养基,分别处理不同时间（24小时、36小时和48小时）,观察CLPP的mRNA和蛋白质表达水平的变化情况,筛选出最佳的葡萄糖和棕榈酸处理浓度和时间。在33.3mmol/l高糖和0.5mmol/l高脂处理Min6细胞48小时后,通过qPCR法分析CLPP表达的变化,同时通过qPCR法和Western法分析线粒体动力学相关基因（MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和FIS1）在mRNA和蛋白质表达水平上的变化情况。结果:同Normal组比,葡萄糖和棕榈酸对于CLPP的表达影响具有时间和剂量依赖性（1.0mmol/l棕榈酸情况除外）。在33.3mmol/l高糖和0.5mmol/l高脂处理Min6细胞48小时后,CLPP的mRNA表达水平最高（p<0.01）,这种影响跟渗透压无关。同Normal组比,在33.3mmol/l高糖和0.5mmol/l高脂处理Min6细胞48小时后,线粒体融合相关的蛋白MFN1的mRNA和蛋白表达水平下降（p<0.05）,线粒体裂变相关的蛋白DRP1的mRNA和蛋白表达水平升高（p<0.01）。结论:高糖、高脂能促进线粒体裂变,抑制线粒体融合。第二部分 在缺乏CLPP时,高糖高脂对线粒体动力学和线粒体功能的影响目的:探讨在缺乏CLPP情况下,高糖、高脂对线粒体动力学及线粒体功能的影响。方法:利用siRNA转染技术抑制Min6细胞CLPP的表达,通过qPCR法和Western法分析不同培养基处理的各组Min6细胞线粒体动力学相关基因（MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和FIS1）在mRNA和蛋白质水平上的表达差异以及通过qPCR法和Western法分析线粒体自噬基因（PINK1和PARKIN）表达的差异,通过流式细胞学技术分析各组细胞凋亡率的差异,通过ELISA法检测胰岛素、试剂盒检测ATP、流式细胞学分析ROS、JC-1法检测线粒体膜潜能、Mito-Tracker Red实验检测线粒体数量和Image Pro Plus 6.0软件计算线粒体面积等来评价各组线粒体功能的差异,最后通过透射电镜分析用不同培养基处理的各组Min6细胞的线粒体形态学的变化。结果:CLPP siRNA可有效减少CLPP蛋白的表达（p<0.05）。分别同HG+NC组和HF+NC组比,在mRNA和蛋白质表达水平上,CLPP siRNA抑制MFN1表达同时增加DRP1表达（p<0.05）。分别同HG+NC组和HF+NC组比,在mRNA和蛋白质表达水平上,CLPP siRNA使PINK1和PARKIN表达增加（p<0.05）。通过流式细胞学分析,同HG+NC组和HF+NC组比,CLPP siRNA使Min6细胞早期和晚期凋亡率均增加（p<0.05）。通过流式细胞学分析,同HG+NC组和HF+NC组比,CLPP siRNA使胰岛素分泌量下降（p<0.05）。同HG+NC组和HF+NC组比,CLPP siRNA 减少 Min6 细胞 ATP 生成量（p<0.05）。CLPP siRNA 增加Min6细胞中ROS生成（p<0.05）。CLPP siRNA能使线粒体膜潜能下降（p<0.05）。通过透射电镜观察,CLPP siRNA处理的Min6细胞表现为线粒体数量明显减少,线粒体表面积明显增大,线粒体密度明显下降,线粒体嵴减少甚至消失,细胞质密度明显下降及细胞质内空泡明显增多。结论:在缺乏CLPP的情况下,高糖、高脂会加剧线粒体的裂变同时抑制线粒体的融合,同时恶化线粒体功能。
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