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研究背景:人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)是导致获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)的病原体。HIV-1 的跨膜糖蛋白gp41在HIV-1众多蛋白中最为保守,能诱导产生多个中和抗体,是免疫检测试剂盒中最为常见的检测抗原及疫苗研发的目标。衣壳蛋白p24在病毒蛋白中含量最为丰富,其氨基酸序列在多种亚型中高度保守,也是感染后最早能检测到的抗原,使其也成为重要的生物标志物。研究发现在HIV-1感染者体内存在体液免疫应答模式的转变,提示我们p24和gp41的免疫优势表位或能成为区分不同感染模式的生物标志物,对建立实验室检测方法有利用价值。研究目的:本课题通过重组表达的p24、gp41蛋白,合成p24、gp41的系列肽段作为包被抗原,探究与HIV-1感染人群外周血与病毒蛋白或肽段的免疫反应特征,探讨HIV-1感染者的体液免疫应答模式及其特点,分析HIV-1感染者体液免疫应答模式与感染者病程进展指标的关联,发现有使用价值的特殊生物标志物,建立能区分不同感染时期的实验室检测方法。研究方法:构建p24的重组表达质粒,转化至大肠杆菌感受态细菌。经过诱导表达可溶性重组蛋白并对重组蛋白进行纯化。表达产物用SDS-PAGE电泳和间接ELISA分析鉴定其活性。收集不同人群来源的HIV-1阳性血浆样本,利用商品化试剂盒将样本区分为近期感染和长期感染,观察不同人群在感染时期分布上的差异。分别合成3条覆盖p24和gp41不同区域的肽段。分析不同人群,不同感染时期的样本与重组蛋白及肽段的免疫反应特点。分析不同感染时期的样本与肽段的免疫应答情况,筛选出具有区分HIV-1不同感染时期能力的肽段。优化反应条件,初步建立区分HIV-1不同感染时期的实验室检测方法。通过与两种商品化试剂盒鉴定结果的比较,评价方法的敏感性和特异性。研究结果:成功构建p24的原核表达质粒并诱导表达,蛋白电泳与预期相符,间接ELISA分析显示p24具有抗原特异性。88.3%(233/264)的样本不与三个覆盖p24主要免疫优势表位的三个肽段反应,与此形成对比的是,87.7%(236/269)的样本至少与一个gp41的肽段反应。随着感染时间的延长,HIV-1感染者体内gp41-p1特异性抗体滴度逐步上升,感染时间与gp41-p1的酶免实验OD值之间的相关系数为0.78。将gp41和gp41-p1作为捕捉抗原,gp41抗体阳性和gp41-p1抗体阴性定义为近期感染,gp41抗体阳性和gp41-p1抗体阳性定义为长期感染,初步建立了一种能区分HIV-1新近和长期感染的实验室检测方法。研究结论:HIV-1感染者针对p24和gp41的体液免疫应答模式存在较大差异,此为依据,初步建立了一种区分HIV-1新近感染和长期感染的实验室检测方法。