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目的：新型甲型H1N1流感病毒是威胁人类健康的重要新发传染病，虽然已有可用于该病毒预防和治疗的疫苗及药物，但现有的神经氨酸酶抑制剂类抗病毒药物和以传统方法制备的流感病毒裂解疫苗均存在一定的局限性。近期研究表明，以重组腺病毒制备流感疫苗具有明显的优越性。本研究以全基因合成的方法获得甲型H1N1流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)基因，并以辅助病毒依赖型腺病毒(Helper-dependent adenoviral vector，HDAd)载体系统为基础，构建可表达HA的重组HDAd，为进一步的体内免疫效果和免疫保护作用研究奠定基础。 方法：根据GenBank上登录的甲流H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株(A/California/07/2009(H1N1))基因序列，采用全基因合成的方法合成由1701个碱基组成的HA编码基因。经核酸序列分析证实后，将HA基因克隆至HDAd穿梭载体pSC11-CMV，经限制性内切酶分析后，进一步将含有HA基因的表达盒克隆至HDAd骨架质粒pSC15B，构建pSC15B/HA重组质粒，并以多组限制性内切酶进行分析鉴定。PmeⅠ消化pSC15B/HA去除原核复制元件及抗性基因，获得HDAd/HA DNA分子，经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞，16 h后感染辅助病毒，收获HDAd/HA载体粗提液，随后以HDAd/HA粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/HA达到复制极限。随后，以HDAd/HA和辅助病毒感染293Cre4细胞大量制备HDAd/HA，CsCl密度梯度及等密度梯度两次超速离心纯化，利用透射电子显微镜观察病毒形态，分子生物学技术体外鉴定HDAd/HA表达情况。 结果：成功构建了可表达甲流H1N1流感病毒HA蛋白的HDAd/HA载体，通过与辅助病毒共感染293Cre4细胞及CsCl梯度法超速离心制备了大量纯化的HDAd/HA载体，透射电子显微镜观察到腺病毒，体外感染293细胞，RT-PCR检测到HA基因有转录。 结论：应用HDAd系统，成功构建了HDAd/HA重组腺病毒，并完成了该病毒的大量制备和纯化，为体内免疫学效力试验奠定了初步基础。