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慢性肾脏病(CKD)现在已经成为全球主要的健康问题,合理食用低蛋白饮食加服用复方α-酮酸片是治疗CKD的重要方法之一。由于复方α-酮酸片为复方制剂,成分复杂,而且以钙盐形式存在,很难用普通反相高效液相色谱法进行定量测定。另外,由于生物样品的基质复杂,容易对目标分析物的分离造成干扰,并且目标分析物的含量一般较低,所以通常需要结合有效的样品前处理技术。中空纤维液相微萃取(HF-LPME)因其操作简便、富集倍数大、成本低,且易与高效液相色谱(HPLC)、气相色谱法(GC)联用等特点,已被广泛应用于尿液、血液等生物样品的分析。本课题拟通过开发一种反相离子对高效液相色谱并结合中空纤维液相微萃取的方法,对人体尿液中复方α-酮酸片的五种有效成分进行检测,从而为CKD的治疗提供检测依据。本论文的主要工作和成果如下:1.建立了一种同时测定复方α-酮酸片中五种有效成分的反相离子对高效液相色谱法。以消旋羟蛋氨酸钙(HMACa)、酮缬氨酸钙(KVCa)、消旋酮异亮氨酸钙(KILCa)、酮亮氨酸钙(KLCa)和酮苯丙氨酸钙(KPACa)五种标准品混合溶液为对象,对离子对试剂浓度、流动相pH值等进行了优化。最终确定流动相:乙腈-20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(含15mmol/LTBAH,pH7.0),25/75(V/V)。研究结果表明,五种标准物质在线性范围(10～150mg/L)内相关系数均大于0.9993,RSD小于3.63%。检出限(LOD)为3.3～5.2 mg/L,加标回收率在85.28%～105.77%之间。本方法简单、快速,灵敏度高,适用于复方α-酮酸片中五种有效成分的质量控制。2.建立了一种同时测定人体尿液中HMACa、KVCa、KILCa、KLCa和KPACa的反相离子对高效液相色谱法。以乙腈-20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(含15mmol/LTBAH,pH7.0)进行梯度洗脱。研究结果表明,五种标准物质在线性范围(20～200 mg/L)内线性关系良好(r均大于0.9990),RSD小于6.61%。检出限为2.5～5.7 mg/L,加标回收率为86.79%～111.12%。该方法样品预处理简单,内源性基质干扰小,对于观察患者服用复方α-酮酸片后的吸收、代谢情况具有重要意义。3.采用中空纤维液相微萃取对尿液中的HMACa、KVCa、KILCa、KLCa和KPACa进行纯化、富集,并用建立好的反相离子对高效液相色谱法进行检测。在该条件下,五种物质的富集倍数分别为11,110,198,202 和 50,线性范围分别为 0.1～10 mg/L(KVCa、KILCa 和 KLCa)和 0.5～10 mg/L(HMACa 和 KPACa),相关系数(r)均大于 0.9903。检出限为5.8～100.7 μg/L且RSD均小于6.27%。加标回收率为91.71～118.00%。本方法灵敏度高、适用于尿液中低含量的复方α-酮酸片的五种有效成分的测定。