论文部分内容阅读
目的:分别探讨慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)于体外及体内经酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)处理后自噬水平的变化及其具体机制,为慢性髓性白血病的基础研究及临床用药奠定基础。方法:1.体外实验1.1细胞培养:慢性髓性白血病K562和KCL22细胞株。1.2采用CCK-8法检测不同浓度的TKI(0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ug/ml)处理K562和KCL22细胞株不同时间(6 h、12 h、18h)增殖抑制率,研究CML细胞系经不同浓度(0.5ug/ml、1.0ug/ml)的TKI作用12h增殖抑制率变化。1.3吖啶橙染色观察空白组及经不同浓度TKI(0.5ug/ml、1.0ug/ml)作用K562和KCL22细胞12小时自噬水平变化。1.4采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测K562及KCL22细胞株未经TKI及经不同浓度的TKI(0.5ug/ml、1.0ug/ml)作用12小时自噬相关因子LC3 B、mTOR、Beclin-1的mRNA和蛋白水平的变化。2.体内实验2.1收集患者:将2017年12月至2019年3月于承德医学院附属医院血液内科就诊的符合CML慢性期诊断标准并规律应用TKI治疗3个月按时随访的10例患者纳入到研究中。2.2提取并冻存骨髓淋巴细胞:从10例明确诊断并规律应用3个月TKI治疗的CML慢性期患者骨髓内提取淋巴细胞,并于-80℃冻存。2.3应用Sysmex XE-2100全自动血液分析仪检测收集的10例患者用药前后的血常规。2.4采用实时定量聚合酶链反应法(RQ-PCR)检测所采集的10例患者骨髓内BCR-ABL融合基因转录本水平。2.5采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测同一初诊并规律应用TKI3个月的CML慢性期患者自噬相关因子LC3 B、mTOR、Beclin-1的蛋白相对表达水平。结果:1.体外实验1.1采用CCK-8法检测K562和KCL22的增殖抑制率:不同浓度(0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ug/ml)TKI处理K562及KCL22不同时间(6、12、18h)后的增殖抑制率,两个细胞系的增殖抑制率随药物浓度的增加及作用时间的延长而增高(P<0.05)。更好观察自噬现象,后续实验选取药物浓度0.5ug/ml和1.0ug/ml,作用时间12h。1.2吖啶橙染色观察CML细胞株K562及KCL22,空白组及经不同浓度TKI(0.5ug/ml、1.0ug/ml)作用12小时,空白组可见稀疏棕红色囊泡,随药物浓度增高棕红色囊泡密度增高。1.3经RT-qPCR和Western Blot分析K562及KCL22经TKI作用后自噬相关因子LC3 B、mTOR、Beclin-1的mRNA和蛋白表达水平变化。自噬相关因子LC3 B、Beclin-1的mRNA和蛋白表达水平在经TKI作用后增高,mTOR表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。2.体内实验2.1 10例患者应用TKI治疗3个月均达完全血液学缓解,10例应用TKI治疗患者BCR-ABL融合基因水平较初诊时下降,但均未达到完全分子生物学反应。2.2经Western Blot分析10例同一明确诊断并规律应用3个月TKI治疗的CML慢性期患者用药前后自噬相关因子LC3 B、mTOR、Beclin-1的蛋白表达水平变化。与同一初诊患者相比,3个月规律应用TKI治疗的CML患者,自噬相关因子LC3B、Beclin-1的蛋白表达水平增高,mTOR蛋白表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.TKI对K562和KCL22细胞株具有增殖抑制作用,且增殖抑制作用呈时间与浓度依赖性。2.CML细胞株存在低水平自噬,同时CML患者体内也存在低水平自噬。3.TKI可使CML细胞株自噬水平增高,并使自噬相关蛋白水平增高,同时可使CML患者体内自噬相关蛋白水平增高。