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背景与目的:肺癌是常见恶性肿瘤之一,临床早期常无症状,易漏诊、转移与复发,预后差。发病率逐年上升趋势,已经成为城市恶性肿瘤的首位死亡原因。迄今,肺癌发生发展及转移的分子调节机制尚未完全明了,越来越多的证据显示多数恶性肿瘤患者均表现不同程度的凝血及纤溶异常,引起了医学研究领域的关注。内皮细胞蛋白C受体(endothelial protein C receptor,EPCR)是蛋白C系统新的成员,是相对分子质量为46kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白,人类EPCR基因定位于20q11.2,可在多种肿瘤细胞及肿瘤组织表达,研究显示EPCR介导了活化蛋白C(APC)诱导的细胞增殖、迁移和凋亡抑制等功能。本研究拟构建EPCR小发夹状RNA(small hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,以特异性抑制EPCR表达,进而检测对肺癌细胞系H1299细胞周期、体外增殖、迁移能力以及相关基因表达的影响,并观察是否能延长荷瘤SCID鼠的生存期。研究方法:以内皮细胞作阳性对照,通过半定量RT-PCR、蛋白印迹、流式细胞仪FCM及免疫组化初步检测EPCR在6种肺癌细胞和其它多种肿瘤细胞及肺癌和癌旁组织的表达情况,并结合临床指标分析其意义。设计和构建能表达针对EPCRmRNA的3个RNA干扰载体(EPCR pshRNA1,2,3 vector)和阴性对照载体(control pshRNA vector),分别通过脂质体介导转染至H1299细胞。用半定量RT-PCR、Real time RT-PCR、Western blotting和免疫荧光及FCM检测未转染质粒的H1299细胞、转染了干扰质粒的H1299细胞和转染了对照质粒的H1299细胞中EPCRmRNA和蛋白表达;经G418筛选(500μg/mL)并稳定传代后,选择EPCR表达显著受抑制的稳转细胞株H1299细胞(H1299/shRNA)和EPCR表达未受影响的对照H1299/Con及亲代细胞,分别通过细胞周期测定、细胞增殖分析、划痕“愈合”模型及相关基因表达等观察肺癌细胞生物活性的改变;分别将三组细胞接种SCID鼠,建立人源化SCID鼠肺癌模型,检测抑制EPCR表达后,SCID鼠的成瘤率、移植瘤的生长速度、移植瘤内微血管密度以及对荷瘤鼠生存期的影响。结果:(1)EPCR在所测的6种肺癌细胞及其它多种肿瘤细胞均有表达,在肺癌组织的表达率显著高于癌旁正常肺组织(P＜0.01);EPCR表达与肺癌临床分期有关,EPCR表达阳性的癌组织中微血管密度MVD显著高于EPCR表达阴性者(P＜0.01)。(2)设计和构建3个pshRNA-EPCR重组质粒,测序证实构建成功;RT-PCR和Western blot显示:与H1299亲代细胞和转染阴性对照质粒的H1299相比,转染干扰重组质粒可显著而特异的降低H1299细胞EPCRmRNA和蛋白的表达(P＜0.01)。(3)使用G418(500μg/mL)筛选并经亚克隆培养获得稳定表达EPCR沉默的肺癌细胞株H1299/shRNA,通过与阴性对照H1299/Con和未转染的H1299细胞相比较发现细胞周期分布发生改变:H1299/shRNA在G1期细胞显著增多,S期细胞减少,MTT和划痕实验表明细胞增殖活性和迁移能力下降(P＜0.01),同时细胞周期蛋白cyclinE、细胞增殖核抗原PCNA及MMP-2表达下调。(4)动物实验发现与阴性对照H1299/Con和未转染的H1299细胞相比,H1299/shRNA组移植瘤的潜伏期和荷瘤SCID鼠的生存期皆明显延长(P＜0.01),移植瘤生长速度显著减缓(P＜0.05),移植瘤内MVD显著下降。结论:(1)肺癌细胞和某些恶性肿瘤细胞均可表达EPCR,肺癌组织表达EPCR与转移及临床分期相关,提示可能参与了肺癌进展和转移。(2)构建的RNA干扰质粒能特异而有效的抑制细胞EPCR表达,使H1299细胞周期分布发生改变,相关基因cyclinE、PCNA及MMP-2表达下调,APC诱导的细胞增殖活性和迁移能力降低。(3)阻滞EPCR表达可抑制SCID鼠移植瘤的生长,并延长荷瘤鼠的生存期,可能与细胞增殖能力下降及抑制肿瘤组织新生血管形成有关。