缺血性脑血管病具有高发病率、高致残性的特点,给患者遗留长期的神经功能缺损,与癌症及心血管疾病并称为威胁人类生存的三大疾病。其发病的主要原因是由于颅内血管重度狭窄或堵塞,以及心脏供血不足等导致局部或全脑组织血液供应下降而引发的神经功能缺损综合征。虽然临床上已采用颈内动脉内膜剥脱术、血管内支架置入术及颅内外血管搭桥术等方法用于恢复缺血区域的血液供应,但是仍然无法从根本上解决缺血后再灌注引发的脑损伤,是目前影响缺血性脑血管病疗效与预后最主要的原因。前几十年对于缺血性脑卒中的研究主要针对神经兴奋性毒性(neurotoxicity)、氧化应激反应、神经炎症以及血管及神经元单位(the neurovascular unit)等领域。但是,近期越来越多的研究发现,脑缺血后膜蛋白运输障碍对再灌注性神经元损伤起至关重要的作用。NSF ATPase,又名N-乙基马来酰亚胺敏感性因子(NSF)ATP酶,是参与膜融合最为关键的因子,实现将囊泡从一个细胞膜组件转移至另一个细胞膜组件。在这个过程中,两个连接膜上的SNARE蛋白形成一个紧密的复合物帮助实现囊泡与靶膜的融合。一旦发生膜融合,NSF ATPase就利用ATP作为能量源通过水解解离这些SNARE复合物,分离后的SNAREs被循环再利用实现下一次的膜融合。NSF ATPase是膜融合后唯一有效能够水解无活性SNAREs复合物的ATP酶,并且除了表达d NSF-1和d NSF-2的果蝇外,大多数生物体中只有一种NSF ATP酶。高尔基体(Golgi apparatus)-晚期内涵体(late endosome)-溶酶体(lysosome)途径作为唯一能够提供溶酶体酶的膜运输通路,可通过消化那些需要被降解的蛋白质来维持细胞内环境的稳定。但当缺血性脑卒中发生时,NSF ATPase大量灭活导致高尔基体-晚期内涵体-溶酶体膜融合运输通路发生一系列连锁反应,包括损坏的高尔基体、运输囊泡以及晚期内涵体的大量堆积,组织蛋白酶B(Cathepsin B)致死性的释放,线粒体发生膜透性(MOMP),最终导致再灌注后延迟性的神经元死亡。近年来,越来越多的证据表明,蛋白水解酶是导致脑缺血再灌注神经元不可逆性死亡的重要因素。本文从“膜运输通路障碍”及“溶酶体破裂”两个方面探讨在缺血性脑损伤中导致神经元死亡可能的分子机制,为今后研究缺血再灌注性脑损伤的发生机制及潜在的防治措施提供依据,并进一步提示选择性的组织蛋白酶抑制剂可能是治疗中风和促进康复新的治疗靶点。本课题组的研究还发现,缺血性脑血管病再灌注时,线粒体发生氧化磷酸化障碍,导致细胞内ATP生成减少引发能量代谢障碍,使细胞质内可溶性的自噬相关蛋白NSF聚集失活,该过程可使囊泡融合的功能发生障碍,进而可能抑制自噬降解途径,引发神经元损伤。为了进一步研究NSF ATPase在高尔基体-晚期内涵体-溶酶体膜蛋白运输通路中的重要作用以及溶酶体内组织蛋白酶B的大量释放对缺血性脑血管病再灌注后神经元死亡的机制,本课题主要进行了两部分研究:第一部分:短暂性脑缺血后NSF ATPase失活导致膜蛋白运输障碍机制的研究目的:利用大鼠全脑缺血(2VO)再灌注损伤模型,验证NSF ATPase失活参与介导缺血性脑血管病后高尔基体-晚期内涵体-溶酶体膜蛋白运输障碍,导致组织蛋白酶B的致命释放和迟发性神经元死亡的机制,为将来治疗缺血后再灌注神经元损伤修复寻找新的线索及治疗靶点。方法:(1)本实验采用体重在280-320克的雄性Wistar大鼠,建立双侧颈总动脉结扎的短暂性全脑缺血(2VO)/再灌注模型。在麻醉状态下夹闭双侧颈总动脉20分钟,然后恢复脑血流再灌注,分别选择复灌后0.5小时,4小时,24小时和72小时灌取脑组织。实验总共分为两组:假手术对照组和脑缺血组。(2)采用HE染色、免疫组织化学染色,Western Blotting方法以及共聚焦显微镜仪器检测对不同血流恢复时间灌取的脑组织进行组织学研究,探索脑缺血发生后参与高尔基体-晚期内涵体-溶酶体膜蛋白运输通路中的相关蛋白表达的水平,空间分布及定位。结果:(1)HE染色结果表明,随着再灌注时间的延长,无论是CA1,CX还是DG区域,20分钟短暂性脑缺血组神经元死亡数量均有不同程度增加,且远高于假手术组;脑缺血组Cx区和CA1区神经元损伤比DG区更明显;迟发性神经元死亡在复灌后24小时即有明显增加,72小时达高峰。(2)锇-铀铅染色透射电镜结果显示,脑缺血组Cx神经元高尔基体片段,运输囊泡,晚期内涵体以及蛋白质聚集物明显堆积,而对照组没有明显变化。(3)免疫荧光组织化学染色及共聚焦显微镜结果分析,20分钟短暂性脑缺血再灌注后24小时便可观察到NSF蛋白聚集物染色,高尔基体完全裂解成荧光点状,随灌注时间延长CTSB蛋白表达增加明显,在复灌后72小时尤为显著,且大约90%发生在CA1。(4)Western blotting结果证实,NSF蛋白条带在再灌注72小时后明显降低;33k Da LE CTSB显著增加,而46k Da pro CTSB及24-25k Da EL CTSB降低,以上结果在统计学上均具有显著性差异(p<0.05)。结论:缺血性脑卒中可引起一系列连锁反应,包括NSF ATP酶失活,高尔基体碎片化,运输囊泡大量积聚和不断胀大的晚期内涵体,以及短暂性脑缺血后致命性CTSB释放和延迟性神经元死亡。第二部分:ATP过度消耗导致膜运输关键蛋白NSF失活并诱导细胞死亡的机制研究目的:利用体外试验检验ATP缺失是否是脑缺血后NSF失活的主要触发因以及NSF的高度表达是否能够保护细胞免受ATP消耗诱导的细胞损伤。方法:(1)建立体外培养CHO细胞ATP缺失再恢复模型。(2)通过LDH及MTT法检测细胞损伤的变化。(3)使用线性甘油梯度离心和差速离心获取不同蛋白组分。(4)Western Blotting及免疫荧光染色方法检测不同组分NSF蛋白表达。结果:(1)ATP消耗诱导NSF在CHO细胞ATP消耗模型中沉积形成蛋白质聚集体,并诱导细胞损伤。(2)NSF高表达能够保护CHO细胞免受因ATP消耗导致的细胞损伤。相比之下,GS28、syntaxin 4和syntaxin 6在该模型中没有显著改变,这表明ATP缺失导致NSF自沉积,而不是沉积NSF-SNARE复合物。NSF E329Q突变体抑制ATP结合活性并复制ATP缺失诱导的细胞损伤,而野生型(wt)NSF的高表达减轻ATP缺失诱导的细胞损伤。结论:缺血期间的ATP消耗导致胞质内可溶性膜融合相关蛋白NSF沉积和失活,导致囊泡运输过程中膜融合障碍;NSF高表达能够在ATP消耗期间和之后克服NSF失活,从而通过保留功能性NSF,为今后及时有效治疗缺血性脑损伤提供新方法。