马红球菌（Rhodococcus equi,R.equi）是导致马属动物发生肺炎的重要病原菌,以感染1-6月龄幼驹为主,感染表现为慢性或亚急性支气管肺炎和广泛性肺部脓肿,有时伴发盲、结肠和肠系膜淋巴结溃疡。马红球菌感染在全球范围内多有发生,病例多集中发生于马场内。在国内,随着人民生活水平的提高,驴的使役作用逐渐向食用倾斜。各地政府也积极出台惠民政策,推动驴养殖业的发展。驴的养殖方式从散养变为集约化养殖,导致驴养殖场易发生群发性细菌感染,现阶段驴群发生马红球菌感染,主要集中高发于集约养殖地区。马红球菌在胞内寄生,感染初期隐匿性强,不易确诊,限制幼驹的存活率,确诊后抗生素治疗存在滞后性,治疗周期长等问题。幼驹经过长期抗生素治疗即使得以治愈,也错过了发育生长的最佳阶段,影响驴的生产性能,给养殖户造成经济损失。同时驴制品以食用、药用为主,抗生素治疗会导致驴相关制品中兽药残留,影响公共卫生安全。目前针对预防马红球菌感染的疫苗或相关生物制品均无市场化应用,面对驴养殖产业的市场需求,对马红球菌病进行疫苗研发,采取有效的预防措施远远胜于抗生素治疗。课题组前期于病驴肺脏中分离出驴源马红球菌SD 1分离株。在此基础上,本研究评价其生物学特性,验证其具有传代稳定性。R.equi SD 1含有p VAPA毒力质粒,为强毒株,可以作为疫苗候选株。通过滴鼻、灌胃、腹腔注射三种方式感染小鼠,滴鼻感染每只小鼠5×1010CFU R.equi SD 1致50%小鼠死亡,同剂量灌胃感染小鼠无死亡,腹腔注射每只小鼠1×10~7CFU R.equi SD 1致40%小鼠死亡。腹腔注射感染小鼠致病性最强,确定以此途径感染小鼠半数致死量为1.58×10~8CFU/只。建立了以小鼠为实验动物的免疫后攻菌模型,用于后期疫苗免疫效力检测。制备以甲醛为灭活剂的马红球菌肺炎灭活疫苗及马红球菌肺炎灭活冻干疫苗,分别肌肉注射免疫小鼠,利用间接Elisa法,包被R.equi SD 1破碎全菌,检测血清中特异性Ig G,免疫后两组小鼠特异性Ig G抗体水平均可达1:20000。冻干前后相同剂量抗原免疫的各组小鼠产生的抗体含量在同一水平,冻干不会影响抗原的免疫原性。疫苗免疫组小鼠接受R.equi SD1攻击后,存活率达到77.8%-88.9%。灭活冻干疫苗免疫驴驹42 d后,免疫组驴驹抗体含量是对照组的5倍。以马红球菌毒力相关脂蛋白VapA及VapG为主要抗原分别与MontanideTMgel 02 PR佐剂混合,制备VapA-Montanide及VapG-Montanide亚单位疫苗。皮下注射免疫小鼠,利用双抗原夹心法包被毒力相关脂蛋白,绘制标准品曲线,测定各组特异性Ig G含量分别为290 ng/L和300 ng/L。同时可激活细胞免疫,其中VapG-Montanide组脾细胞中CD4+/CD8+T细胞比值相比对照组显著升高。免疫攻菌后感染症状出现期从3 d延长至7 d,保护率分别为85.7%和100%。分别以VapA、VapG以及VapA-VapG组合制备自佐剂疫苗免疫小鼠,利用双抗原夹心法包被毒力相关脂蛋白,绘制标准品曲线,测定VapA组、VapG组以及VapA-VapG组特异性Ig G含量分别为263 ng/L、258 ng/L及304 ng/L,VapA组和VapA-VapG组保护率分别为28.6%和42.9%。以上三组小鼠脾细胞中CD4+/CD8+T细胞比值相比对照组有上升趋势,说明VapA具有自佐剂功能。本研究制备了马红球菌驴驹用灭活疫苗,开展了制剂研究,对驴驹进行免疫接种实验表明,可有效提升驴驹体内马红球菌抗体水平。制备了分别以毒力相关脂蛋白VapA与VapG为主要抗原的亚单位疫苗,免疫小鼠后具有高水平的免疫保护力。并为进一步探究脂蛋白作为自佐剂疫苗的开发提供了实验基础。