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研究背景:环境内分泌干扰物(Environmental Endocrine Disruptors,EED)是环境污染物中的重要成分,在机体内具有激素样作用;其主要来源于杀虫剂、塑料、洗涤剂、燃烧产物及工农业产物。近年来,EED的污染已成为全球关注的重要议题,EED对性激素敏感性恶性肿瘤的影响成为研究热点。神经母细胞瘤是最常见的小儿恶性实体肿瘤之一,其病因及机制不清。已发现环境内分泌干扰物是神经母细胞瘤重要的促瘤因素,选择一种能有效抑制环境内分泌干扰物促瘤作用的物质对于肿瘤的防治有着重要的意义。PI3K/Akt信号转导通路广泛存在细胞中,是参与细胞生长、增殖、分化调节的信号转导通路,可被G蛋白偶联受体和(或)蛋白酪氨酸激酶受体激活,也可被Ras蛋白激活。多种生长因子主要通过PI3K/Akt信号转导通路而发挥作用。业已证实PI3K/Akt通路在人类某些恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。5,7,4’-三羟异黄酮(Genistein,GEN)是一种蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂,为常见的黄酮类化合物,是大豆的重要成份;是当前研究大豆类异黄酮生物学效应的主要代表物。GEN作为一种植物雌激素,与17β-雌二醇结构相似,能够与17β-雌二醇竞争和雌激素-β受体相结合,发挥弱雌激素或抗雌激素作用,在肿瘤的发生、发展阶段存在多重抑制效应。GEN对环境内分泌干扰物引起的肿瘤细胞增殖效应是否具有抑制作用,目前国内外尚未见报道。研究目的:本研究观察GEN对环境内分泌干扰物双酚A(BPA)和邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)诱导的神经母细胞瘤细胞增殖作用的影响,并初步探讨其作用机制及PI3K/Akt信号转导通路在其中的变化,为暴露于环境污染中的儿童预防神经母细胞瘤开辟新的途径。材料与方法:一、GEN抑制BPA、DEHP诱导的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖效应实验体系的建立:SK-N-SH细胞经常规培养扩增后分为24组:组1,RPMI1640无酚红培液加无水乙醇(对照组);组2,加GEN1(浓度为2μmol/L):组3,加GEN2(浓度为5μmol/L);组4,加GNE3(浓度为12.5μmol/L);组5,加GEN4(浓度为25μmol/L);组6,加GEN5(浓度为50μmol/L);组7,加E2;组8,加BPA;组9,加DEHP;组10,同时加入E2+GEN1;组11,同时加入E2+GEN2;组12,同时加入E2+GEN3;组13,同时加入E2+GEN4;组14,同时加入E2+GEN5;组15,同时加入BPA+GEN1;组16,同时加入BPA+GEN2;组17,同时加入BPA+GEN3;组18,同时加入BPA+GEN4;组19,同时加入BPA+GEN5;组20,同时加入DEHP+GEN1;组21,同时加入DEHP+GEN2组;22,同时加入DEHP+GEN3;组23,同时加入DEHP+GEN4;组24,同时加入DEHP+GEN5。培养72 h检测细胞光吸收度值(AV)观察细胞增殖情况。二、GEN对BPA、DEHP诱导的SK-N-SH细胞增殖效应影响的体外增殖实验:SK-N-SH细胞经常规培养扩增后分为8组:组1,RPMI1640无酚红培液加无水乙醇(对照组);组2,加GEN(GEN组);组3,加E2(E2组);组4,同时加E2和GEN(E2+GEN组);组5,加BPA(BPA组);组6,同时加BPA和GEN(BPA+GEN组);组7,加DEHP(DEHP组);组8,同时加DEHP和GEN(DEHP+GEN组)。分别在24、48和72 h检测细胞光吸收度值(AV)。同时72 h用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡指数(AI)。并在72 h时采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)观察细胞凋亡情况,Western blot分析法检测Caspase-3蛋白表达。三、PI3K/Akt信号转导通路在GEN抑制环境内分泌干扰物促神经母细胞瘤增殖效应中变化的实验研究:SK-N-SH细胞经常规培养扩增后分为8组:组1,RPMI1640无酚红培液加无水乙醇(对照组);组2,加GEN(GEN组);组3,加E2(E2组);组4,同时加E2和GEN(E2+GEN组);组5,加BPA(BPA组);组6,同时加BPA和GEN(BPA+GEN组);组7,加DEHP(DEHP组);组8,同时加DEHP和GEN(DEHP+GEN组)。72 h检测细胞光吸收度值(AV)。同时采用Western blot分析法检测Akt蛋白及其磷酸化蛋白(p-Akt)的表达。结果:一、GEN抑制BPA、DEHP诱导的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖效应实验体系的建立:SK-N-SH细胞经不同浓度的GEN作用72 h时,GEN不同浓度组对细胞生长的影响不同。与对照组(AV为0.79±0.14)比较,2μmol/L和5μmol/L浓度组AV分别为0.97±0.05和0.94±0.08,具有促增殖作用(p＜0.01);12.5μmol/L浓度组的AV为0.77±0.07,与对照组比较,有抑制生长趋势,但无统计学差异;而25μmol/L、50μmol/L浓度组的AV分别为0.63±0.02和0.43±0.02,具有明显抑制作用(p＜0.05)。当加入E2及BPA、DEHP后,GEN对各组细胞生长的影响有所不同。对E2诱导的细胞增殖,同时加入GEN和E2时各组的细胞AV分别为0.93±0.03、0.89±0.03、0.82±0.06和0.72±0.05,较单独加入E2组有降低,具有明显的统计学差异(p＜0.01)。对BPA诱导的细胞增殖,同时加入GEN和BPA时各组细胞AV分别为0.97±0.07,0.92±0.02,0.85±0.07,0.84±0.07,0.83±0.03,较单独BPA组均有下降,具有明显统计学差异(p＜0.001)。而对DEHP诱导的细胞增殖,加入GEN的组22、23、24的AV为0.88±0.04,0.87±0.01和0.72±0.11,较单独DEHP组有降低,具有统计学差异(p＜0.01),而组20、21与未加入GEN组比较无统计学差异。二、GEN对BPA、DEHP诱导的SK-N-SH细胞增殖效应影响的体外实验:SK-N-SH细胞经GEN及E2、BPA、DEHP作用后,各时点的AV有所不同,24h时,加入GEN组与未加入GEN组比较,细胞AV略有降低,但其差别无统计学意义。作用48h时,各EEDs组联合GEN作用后的细胞AV较单独EEDs组有降低。其中组4(E2+GEN组)的AV是组3(E2组)的75%,降低了25%,两者比较具有显著的统计学差异(p＜0.001)。对BPA而言,同时加入GEN和BPA的细胞AV降低为0.58±0.09,是单独BPA作用组(0.75±0.02)的77%,两者比较具有显著的统计学差异(p＜0.001);同样,组8(DEHP+GEN组)的AV较组7(DEHP组)也有降低,两者之间的差异具有显著统计学意义(p＜0.001)。作用72h时,结果与48h时类似;联合GEN作用的各EEDs组细胞AV较单独EEDs组有降低,两者比较具有明显统计学差异(p＜0.001)。72h时对各组细胞周期进行分析,EEDS联合GEN各组的G2/M期细胞所占比例明显增加,与单独EEDs组比较具有统计学意义(p＜0.01),而sub-G0期(凋亡亚二倍体峰)、凋亡指数及Caspase-3蛋白表达各组之间无统计学差异(p＞0.05)。三、PI3K/Akt信号转导通路在GEN抑制环境内分泌干扰物促神经母细胞瘤增殖效应中变化的实验研究:72h时Western blot检测发现EEDs联合GEN的各组较单独EEDs组的Akt及p-Akt的蛋白表达降低,两者之间的差异具有统计学意义(p＜0.05)。结论:1.GEN对神经母细胞瘤细胞生长呈双向作用,具有浓度依赖性。2.GEN可通过细胞周期G2/M期阻滞抑制环境内分泌干扰物对人神经母细胞瘤细胞促增殖作用。3.GEN可能干扰PI3K/Akt信号转导通路的细胞信号转导,从而抑制环境内分泌干扰物促人神经母细胞瘤细胞的增殖。4.GEN对环境内分泌干扰物促神经母细胞瘤细胞生长的抑制作用,凋亡可能不是主要途径。